TD TILLING Articles à lire Henikoff et al., 2004. TILLING. Traditional Mutagenesis Meets Functional Genomics. Plant Physiol., 135 : 630-636. Slade et al.,

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1 TD TILLING Articles à lire Henikoff et al., 2004. TILLING. Traditional Mutagenesis Meets Functional Genomics. Plant Physiol., 135 : 630-636. Slade et al., 2005. A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING. Nature biotechnol., 23(1) : 75-81. Gilchrist et al., 2006. Use of Ecotilling as an efficient SNP discovery tool to survey genetic variation in wild populations of populus trichocarpa. Mol. Ecol., 15 : 1367-1378.

2 TD TILLING Questions – article 1 Que signifie tilling ? Faite un schéma explicatif du fonctionnement du tilling. Indiquer les étapes qu’il est nécessaire d’optimiser. Faire un schémas montrant les avantages et inconvénients du tilling par rapport à la mutagenèse insertionnelle par ADN-T et transposon, au RNAi et à la mutagenèse par « fast neutron ». Questions – article 1 Que signifie tilling ? Faite un schéma explicatif du fonctionnement du tilling. Indiquer les étapes qu’il est nécessaire d’optimiser. Faire un schémas montrant les avantages et inconvénients du tilling par rapport à la mutagenèse insertionnelle par ADN-T et transposon, au RNAi et à la mutagenèse par « fast neutron ». Questions – article 3 Qu’est-ce que l’écotilling ? Différences avec le tilling ? Quel était le but de l’écotilling ? Questions – article 3 Qu’est-ce que l’écotilling ? Différences avec le tilling ? Quel était le but de l’écotilling ? Questions – article 2 Expliquez l’application de tilling sur le blé. Quels avantages voyez vous à faire du tilling pour améliorer des espèces polyploïdes comme le blé ? Questions – article 2 Expliquez l’application de tilling sur le blé. Quels avantages voyez vous à faire du tilling pour améliorer des espèces polyploïdes comme le blé ?

3 TD TILLING Définition du TILLING Targeting Induced Local Lesion IN Genome Et technique mise au point par M. Till

4 TD TILLING Mutagenèse chimique MSE M1 M2 Banque de graines mutant MSE (M2) Réalisation de pools d’ADN pour criblage PCR avec amorces spécifiques d’un gène (marquage dye 700 –dye 800) Dénaturation Renaturation CEL I Dénaturation - + gel LI-COR PCR sur les plantes isolées (endonucléase simple brin)

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6 Mutagenèse chimique MSE Pourquoi EMS (Ethyl Methane Sulfonate) et pas autre mutagène ? Sur quels organismes le tilling est-il utilisé ? A plus de 99% transition G/C en A/T D’abord chez les plantes… Arabidopsis thaliana, maïs, lotier, tomate, blé Drosophile, zebrafish Est-il possible d’utiliser une banque de mutant existante ? Oui CAA (Glutamine) TAA (stop) CTT (Leucine) TTT (Phenylalanine) TTC (Phenylalanine)

7 TD TILLING Mutagenèse chimique MSE Doit-on obligatoirement faire une mutagenèse sur des graines ? Non – possibilité de mutagenèse du pollen Avantage : permet d’éliminer des mutations létales - chimérisme Inconvénient : moins de mutation car un seul génome (Comai et Henikoff, 2006)

8 TD TILLING M1 M2 Banque de graines mutant MSE (M2) Doit-on obligatoirement faire l’extraction d’ADN sur les plantes M2 ? Problème de dilution de la mutation ? M1 : 50% m / 50% + m + M2 : 50% m / 50% + m + mm m m m + ++ ++ M3 : 50% m / 50% + NON Problème au cas où la mutation affecte positivement ou négativement la plante NON

9 TD TILLING PCR avec amorces spécifiques d’un gène (marquage dye 700 –dye 800) Extraction d’ADN ADN très pur pour la PCR se déroule dans des conditions optimales. Taille des pools Dilution de l’ADN. Dilution de la mutation. Un pool de 8 plantes = 1 mutation pour 15 sauvages Dépend de la taille du génome A.thaliana (8x96) maïs (4x96) Dépend de l’objectif - Systématique dilué : si on passe a coté de quelques mutants c’est pas grave. - Ciblé peu dilué : on veut toutes les mutations possible pour notre gène d’intérêt. Définition des amorces logiciel CODDLE (Codons Optimized to Detect Deleterious Sequences in Genome)

10 TD TILLING CEL I (endonucléase simple brin) Détection des hétéroduplex Denaturing HPLC (DHPLC) Repère le mésappariement mais ne permet pas de le localiser : nécessité de séquençage Temps CHALEUR Méthode de SNP (pyroséquençage,…) Utilisation d’autres nucléase simple brin

11 TD TILLING EXEMPLES DE REALISATIONS ATP Arabidopsis Tilling Project(Greene et al., 2003) : population 3000 M2. Pour 400 gènes (1kb) 4000 mutations Maïs (Till et al., 2004) Population 750 plantes. Pour 11 gènes d’intérêt (1kb) 17 mutations Obtention d’un allèle chromométhylase (méthylation – silencing épigénétique)

12 TD TILLING 10 00 plantes suffisent pour saturer le génome Amélioration des plantes Pas de transgénèse Possibilité d’utiliser les banques EMS existantes. Tadege et al., 2005

13 TD TILLING Quels avantages voyez vous à faire du tilling pour améliorer des espèces polyploïdes comme le blé ? Waxy chez le riz : riz gluant. Teneur très réduite en amylose Amidon: chaine de glucose (amylose) + chaine de glucose ramifié (amylopectine) Mutagenèse à l’EMS de Variété Express : blé tendre (génome A, B, D) (délété waxy B) Variété Chronos : blé dur (génome A et B) 1920 individus Génome du blé = 17000 Mb (140 fois plus qu’A.thaliana) (très difficile pour saturer le génome en mutation par insertion) Génome du blé = 17000 Mb (140 fois plus qu’A.thaliana) (très difficile pour saturer le génome en mutation par insertion) Difficulté pour trouver des mutants Peut-on isoler des allèles des gènes WAXY ? gène à effet inverse de celui responsable de la mutation pois ridé GBSSI granule-bound starch synthase

14 TD TILLING Quels avantages voyez vous à faire du tilling pour améliorer des espèces polyploïdes comme le blé ? Paire d’amorce qui amplifie tous les allèles Taille différente selon le chromosome. Vérification des génotypes Paire d’amorce qui amplifie tous les allèles Taille différente selon le chromosome. Vérification des génotypes Recherche d’amorces spécifiques. Si pas d’amplification dans un individu délété pour le gène : amorce bien spécifique du gène. Amorces spécifiques de WxD Amorces spécifiques de WxB Amorce spécifique de WxA Contient le WxA (translocation) Express Chinese Spring –WXA1 Chinese Spring – WxB1Chinese Spring – WxD1 Rôle de la manip de la figure 1 ? Possibilité de faire du TILLING avec ces amorces spécifiques

15 Résultats : Découverte de 246 allèles de waxy Résultats : Découverte de 246 allèles de waxy

16 TD TILLING Quels avantages voyez vous à faire du tilling pour améliorer des espèces polyploïdes comme le blé ? Détection de l’amylose dans les différents mutants Pas d’amylose que de l’amylopectine Pas d’amylose que de l’amylopectine Le TILLING est donc une technique utilisable pour la recherche de mutants intéressants agronomiquement chez le blé

17 TD TILLING Quel type de population est utilisé pour faire de l’écotilling dans l’article de Gilchrist et al., 2006? Individus issus de 41 populations de peupliers Canadiens

18 TD TILLING Combien de marqueurs SNP ont –ils été trouvés dans l’article de Gilchrist et al., 2006? 9 gènes

19 TD TILLING Qu’est ce que l’écotilling ? Tilling sur des populations naturelles. Pour exemple Comai et al., 13 accessions Amorces de DRM1 – seul canal 700 Accessions 2, 4, 5, 6, 7,11 pas différents de l’écotype de référence Principe 1: mélange d’un écotype avec l’écotype de base. Possibilité de faire des hétéroduplexes. Cas de l’accession 3. Principe 2: CEL1 ne fonctionne pas à 100% Possibilité de voir les mésappariements multiples Cas des accessions 12 et 13.

20 TD TILLING Pourquoi les auteurs ont-ils recherché des marqueurs SNP? Variabilité dans les gènes = outils pour faire de la phylogénie moléculaire. Comprendre comment l’espèce à évoluer et a conquis de nouveaux territoires. Historique. Pour le sélectionneur : méthode pour évaluer la diversité des plantes dans son germplasm. Permet d’éliminer des plantes trop proches.