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APPLICATIONS PRATIQUES DE LA TECHNIQUE DE PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL Congrès ATC 2012 Myriam SEJOR Laboratoire de Cytogénétique Service du Pr B. BENZACKEN.

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1 APPLICATIONS PRATIQUES DE LA TECHNIQUE DE PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL Congrès ATC 2012 Myriam SEJOR Laboratoire de Cytogénétique Service du Pr B. BENZACKEN Hôpital Jean VERDIER

2 La PCR quantitative en temps réel

3 Principe de la PCRq Les trois étapes dun cycle de PCR: 1.Dénaturation95°C1 min 2.Hybridation 55-60°C1 min 3.Élongation72°C1 min ~ 35 cycles

4 Principe de la PCRq PCR classique En PCR classique, le produit amplifié est détecté lorsque les cycles de PCR sont terminés. PCR quantitative La PCR quantitative détecte et mesure laccumulation du produit amplifié au cours de la réaction (détection rendue possible en ajoutant une molécule fluorescente au mélange réactionnel). Le thermocycler mesure une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité dADN amplifié à chaque cycle.

5 Chimie SYBR Green Fluorochrome sintercalant spécifiquement dans lADN double brin nouvellement synthétisé. Sous une excitation UV, émet un signal de fluorescence dont la mesure permet de quantifier lADN double brin.

6 Autre marqueur fluorescent Sonde fluorescente spécifique: La technologie TaqMan®

7 Cycles de la PCRq

8 Principe de la PCR Augmentation du nombre damplicons (produits de PCR) selon une exponentielle dordre 2 (2 n ) droite en échelle logarithmique jusquà épuisement des réactifs (dNTP, amorces…) plateau

9 Une ligne seuil dintensité de fluorescence est déterminée arbitrairement (au-dessus du bruit de fond) de façon à ce quelle coupe la courbe damplification dans la phase exponentielle de la PCR. La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle » Ct

10 La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle » Plus quantité ADN diminue Plus Ct augmente. Donc le Ct est inversement proportionnel au nombre de copies dADN initiales à amplifier, doù laspect quantitatif de la PCRq. Le Ct est reproductible.

11 La quantification relative Détermination du nombre de copies dun gène dintérêt cible relativement au nombre de copies dun gène de référence. Gène de référence: PTEN sur le chromosome 10 Gène servant de Contrôle interne: gène du facteur IX (F9) sur le chromosome X. Un témoin masculin et un témoin féminin.

12 La quantification relative La méthode de calcul utilisée par le logiciel StepOne est la méthode des Ct : Méthode des Ct : 1. Ct gène cible – Ct gène de référence = Ct Ct patient – Ct témoin = Ct 3. Variation de 2 - Ct Livak et al 2001, Methods

13 Choix des amorces Amorce: petites séquences oligonucléotidiques (~20b) bornant la séquence cible à amplifier. Utilisation de plusieurs sites informatiques de bases de données: Site Database of Genomic Variants (DGV) Site Ensembl Site NCBI logiciel PrimerBlast

14 Choix du gène cible sur DGV Localisation de la séquence cible, trouvée anormale en ACPA. Choix du gène qui paraît le plus pertinent.

15 Choix des séquences sur Ensembl ADN génomique du gène cible. Distinction exons/introns. Possibilité de choisir des séquences contenant des exons pour le choix des amorces.

16 Choix des amorces par PrimerExpress Logiciel recherchant les 50 meilleures combinaisons de paires damorces (« forward » et « reverse »), à partir de la séquence cible choisie. Sélection des amorces ne comportant pas (dans la mesure du possible): Configuration en « hairpin » ou épingle à cheveux Formation de « self-dimer » et « cross-dimer »

17 Spécificité des amorces sur PrimerBlast (NCBI) Vérification de la fixation spécifique de la paire damorces choisie sur la séquence cible. PrimerBlast permet de savoir si les amorces ne se fixent pas ailleurs sur le génome humain.

18 Test defficacité des amorces par PCRq Gamme détalonnage en cinq points faite avec un ADN témoin. PCR réalisée en duplicate. Élaboration dun plan de manipulation (plaque de 96 puits). Appareil à PCRq en temps réel: StepOne Plus. Efficacité acceptée entre 90% et 125%.

19 Technique de PCRq PCRq faite pour le patient et pour ses parents en même temps: détermine caractère de novo ou hérité de lanomalie. Chaque échantillon dADN (patient, parents, témoins M et F) fait en triplicate. ADN dilué à 5 µM. Gène de référence PTEN. Gène de contrôle interne F9. Puits contrôle négatif en duplicate. Élaboration dun plan de technique (plaque de 96 puits). Feuille de calcul des Mix de PCR.

20 Technique de PCRq Appareil PCRq StepOne Plus. Durée de la PCRq: 2h30. Résultats analysés par le logiciel de lappareil. Résultats sous forme de courbes, graphes et diagrammes.

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23 Cas Pratique: Duplication Enfant de 8 ans (garçon) Clinique: omphalocèle, malformations ophtalmologiques Caryotype normal Résultat ACPA : duplication en 3p26.3 Taille : 413 kb

24 Résultat ACPA

25 Gène cible sur DGV

26 Test defficacité des amorces

27 Résultat PCRq PatientMèrePère

28 Cas Pratique : Délétion Enfant de 13 ans (fille) Clinique: Psoriasis, hypotrophie, retard de croissance, paraplégie spastique Caryotype normal Résultat ACPA : délétion en 13q12.11 Taille : 80 kb délétion non visible en technique de FISH

29 Résultat ACPA

30 Gène cible sur DGV

31 Test defficacité des amorces

32 Résultat PCRq PatientMère

33 Enfant de 10 ans (fille) Clinique: dysmorphie, retard psychomoteur Caryotype normal Résultat ACPA : triplication en 12p12.3 Taille : 1,3 Mb Cas Pratique : Triplication

34 Résultat ACPA

35 Gène cible sur DGV

36 Test defficacité des amorces

37 Résultat PCRq PatientMèrePère

38 Test en une seule fois du patient et des parents Meilleure résolution que la FISH pour les duplications Rapide (partie analytique) Reproductible Spécifique du gène cible Ne nécessite que de petites quantités dADN du patient (200ng/patient) Mise au point et commande de nouvelles amorces pour chaque anomalie à vérifier Partie pré-analytique longue Nécessité de réplicas Peu de patient par plaque de PCR (96 puits) (deux familles au max) Avantages Difficultés

39 Remerciements Pr Brigitte BENZACKEN, chef de service Dr Andrée DELAHAYE (PCRq) Dr Eva PIPIRAS (ACPA) Toute léquipe technique du laboratoire: Evelyne, Céline, Nathalie, Véronique et Jean.

40 Merci de votre attention


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