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1 DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New Tools: SNP arrays,mutations, Expression profiles DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC.

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1 1 DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New Tools: SNP arrays,mutations, Expression profiles DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New Tools: SNP arrays, mutations, Expression profiles S. D. Raynaud Département dHématologie Biologique CHU de Nice

2 2 Trois décennies de recherche en onco-hématologie Génétique Moléculaire Protéomique / NGS / Génomique Fonctionnelle Cytogénétique Génomiquetranscriptomique Bases moléculaires des hémopathies => Amélioration de la prise en charge des patients

3 3 Délétion: caryotype Régions communes de délétion, double minutes, homogenous staining regions, caractérisation des gènes partenaires de translocations. Del 16q Normal Cytogénétique Délétions, amplifications, double minutes, caractérisation des partenaires dune translocation. FISH Délétion p53 Délétion Southern blot : délétions et amplifications Techniques classiques de détection des déséquilibres chromosomiques et géniques

4 4 Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des déséquilibres chromosomiques Méthode Résolution (Sensibilité en % cell anormales) Détection des UPD Nécessite Cellules en division Distinction entre clones individuels Caryotype sur métaphases Faible (10 à 15%) NonOui FISHFaible (élevée) Non Oui CGH arraysElevée (20- 30%) Non SNP arraysTrès Elevée (20- 30%) OuiNon FISH: Fluorescent in situ HybridizationCGH: Comparative Genomic Hybridization SNP: Single Nucleotide PolymorphismUPD: Uniparental Disomy

5 5 Support solide (verre, plastique, métal, silicone) Chip = cible miniaturisée composée de clones ADNs (BAC, PAC, P1s, oligonucleotides) Taille des clones variable (oligomères à 200 kb Nombre de clones par array: 250 k Basée sur principe biochimique de lhybridation complémentaire ADN/ADN ADNs test et référence sont marqués par fluorescence : Cy3 (tumeur) / Cy5 (référence) Hybridation compétitive des ADNs test et référence sur les séquences cibles Nouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPE

6 6 ADN (0.1 g à 5 g) marqué par random priming avec incorporation de colorants fluorescents (Cy3 & Cy5) Dénaturation dADN Cot-1 et de lADN marqué Pré-hybridation ADNs marqués appliqués sur la lame Hybridation (conditions variables) Lavages Puces scannées, puis étapes de quantification du signal, normalisation, et exploitation des données grâce à des logiciels dédiés Plateformes spécifiques (four à hybridation, station de lavage, scanner, logiciels informatiques dédiés) CGH sur microarray : LA TECHNIQUE

7 7 Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arrays Détection des gains et pertes de matériel génétique Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

8 8 Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arrays Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

9 9 Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q D13S319 / D13S25 (Microarray 300 Abbott)

10 10 Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32 LLC stade A avec Del 13q Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32

11 11 Délétions multiples / Ampli 9q11.2 LLC stade A avec Del 13q Délétions multiples / Ampli 9q11.2

12 12 Délétion: LOH marqueur microsatellite Etude des LOH par analyse des Microsatellites Paradigme de la progression tumorale: Mutation dun allèle, perte de lallèle normal et duplication de lallèle anormal.

13 13 Single nucleotide polymorphism (SNP) TGCAT GCATGCA : Allele A TGCAA GCATGCA : Allele B CHIP ADN Sonde SNP Oligonucléotide Analyse des cancers humains par SNP-CHIP

14 14 Data analysis of SNP-CHIP Heterozygosity (A/B) Allele A Allele B Hybridized signal Matched Normal Hybridized signal Tumor Allele B is missing in Tumor Gene dosage reduction Gene dosage reduction Homozygosity (A/A) Allele specific gene dosage Total gene dosage Allele A Allele B Matched Normal Tumor Allele specific Total gene dosage

15 15 A gauche, technique utilisée par Affymetrix SNP-A; à droite, bead array plateforme utilisée par Illumina (San Diego, CA), incluant les variants 1 et 2 couleurs utilisés par les arrays Infinium I et II X (Illumina). Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112: Analyse bioinformatique: Mesure les pertes dhétérozygotie par génotypage (fréquence des calls hétérozygotes) et détermination de lintensité des signaux dhybridation. Traitement des données via différents logiciels. Ex. CNAG qui combine lanalyse des CNV et des LOH Résultats à évaluer en tenant compte de la variabilité normale du génome: 12% du génome contient 1500 régions variables (CNV) type duplications et délétions taille moyenne de chaque CNV 20Mb Des centaines de gènes sont en CNV Détection des CNA et UPD Principes de base des techniques de SNPs appliquées au caryotypage moléculaire (allelo-karyotyping)

16 16 Chromosome 9 Dosage génique Héterozygotie Dosage génique spécifique dallèle LOH Délétion homozygote Délétion hétérozygote Réduction du Dosage Génique Barres roses : LOH détectées dans tumeurs Un allèle est absent, lautre allèle est intact

17 17 Chromosome 9 (UPD) Chromosome 10 (Normal) Dosage génique Hétérozygotie Dosage génique spécifique dallèle Dosage génique normal LOH: Loss of Heterozygosity Un allèle délété (Vert) Un allèle amplifié (Rouge) : Uniparental disomie (UPD)

18 18 Entraînent LOH sans anomalie du dosage génique. Ce phénomène concerne des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Dispersés sur tout le génome. Conséquences potentielles en oncologie: duplication dun gène muté, homozygotie dun allèle de susceptibilité, duplication dun gène avec profil de méthylation atypique, haploinsuffisance... Attention: Ne pas confondre avec faux LOH ou LOH reliquat dune étape précoce de lembryogénèse LOH détectés chez 8% à 10% individus contrôles Tous sont interstitiels et ont une taille moyenne de 8,7Mb (Maciejewski et al, Blood 2008) Toute lésion interstitielle <24.8Mb (95% CI) est exclue ou doit être confirmée par étude du tissu sain du patient (Maciejewski et al, Blood 2008). Identification de UPD somatiques

19 19 ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR LIDENTIFICATION DUNE ANOMALIE CHROMOSOMIQUE DORIGINE SOMATIQUE Exclure une CNV par :la taille de lanomalie sa localisation le % de recouvrement avec une CNV connue SNP-a Confirmé par MC ou FISH Ne pas pousser plus loin linvestigation Détection dune lésion Micro délétion Microduplication UPD télomérique Interstitiel 25Mb Interroger CNV database CNV connuPas de CNV Germline Probablement somatique Somatique Probablement non somatique Confirmer sur CD3+ Daprès Maciejewski, Patras 2009

20 20

21 21

22 22

23 23 Place des SNP- et CGH-arrays dans lanalyse des SMD/AML Objectifs principaux : Démembrement des anomalies cryptiques Impact sur le pronostic (révision potentielle des scores pronostiques) Corrélation avec réponse aux nouvelles molécules thérapeutiques Quelques cibles des investigations pangénomiques : SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array- CGHSMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array- CGH SMD avec del(5q)SMD avec del(5q) SMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevéSMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevé Formes frontières SMD/SMPFormes frontières SMD/SMP

24 24 Cohorte de 175 patients Fig. 5 Type, frequency, and number of lesions detected by MC and SNP-A. (A) The frequency of chromosomal aberrations and noninformative results as detected by both MC and SNP-A. The insert in the SNP-A pie chart shows the portion of acquired UPD, either as the sole change or in addition to other abnormalities. (B) The percentage of patients with 0, 1, 2-3, and more than 3 lesions, respectively, as detected by MC ( ) and SNP-A (). Pie charts demonstrate distribution of low versus advanced stage of MDS within noninformative and normal karyotypes detected by MC and SNP-A. Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS, MDS/MPD, and MDS-derived AML. Gondek LP et al., Blood Feb 1;111(3):

25 25 Impact sur la survie du SNP-A caryotypage (Maciejewski, Patras 2009) Grouping by lesionsSurvival Low risk – No additional SNP lesions NR Low risk – with additional SNP lesions 157 months Advanced risk – No additional SNP lesions 21 months Advanced risk – with additional SNP lesions 9 months 1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS 2 - Survival outcome for new recurrent lesions Anomalies des Chromosomes 7, 11, 17 et 6, détectées par SNPs: valeurs de p très significatives (Log rank p=<0.0001)

26 26 UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:

27 27 UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes Région de UPDGèneMaladie UPD9qJAK2MPD UPD13qFLT3-ITDAML UPD17qNF-1JMML UPD17pTP53sAML UPD21qRUNX1AML UPD19q CEBP AML UPD4qTET2MDS, AML, MPD UPD1pC-MPLMDS/MPD, MPD UPD11pWT1AML UPD11qC-CBLCMML, sAML Ces régions de UPD sont aussi celles de mutations mono/bialléliques connues de nombreux gènes (JAK2, FLT3, c6MPL W515L, NRAS, p53, RUNX1…) Profil Génomique des LMMC : 43% UPD 4q24 (TET2) 37% UPD 11p (WT) 12% UPD 11q23.3 (CBL) 8% UPD 1p13.2 (NRAS)

28 28 Copyright ©2009 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply. Grimwade, D. et al. Hematology 2009;2009: Frequency of prognostically relevant molecular and cytogenetic subgroups of AML arising in younger adults

29 29 Copyright ©2010 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply. Dohner, H. et al. Blood 2010;115: Figure 1 Pie chart illustrating the molecular heterogeneity of cytogenetically normal AML based on mutations in the NPM1, CEBPA, MLL, FLT3 (ITD and TKD mutations at codons D835 and I836), NRAS, and WT1 genes

30 30 nouvelles méthodes de séquençage massif clonageamplification moléculaire Trois méthodes Depuis 2005 de nouvelles méthodes de séquençage massif ayant en commun le clonage et l'amplification moléculaire ont été développées. Ces méthodes permettent damplifier spécifiquement un fragment dADN isolé soit dans des microgouttes dhuiles (GS-FLX, Roche) soit par fixation sur lame (Solexa). Les étapes de clonage bactérien particulièrement longues sont ainsi évitées. Trois méthodes utilisent actuellement ce nouveau système : GS Flex 1.le GS Flex basé sur l'amplification de l'ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et le pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate) Solexa 2.le Solexa basé sur l'amplification, laccrochage-liaison sur puce et l'utilisation de terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes, SOLID 3.le SOLID basé sur l'amplification par émulsion et l'hybridation-ligature chimique. nouvelles perspectives Ces méthodes offrent de nouvelles perspectives dans de nombreux domaines tels que la génomique médicale (impact majeur dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques). Ley et al., Nature, 2008Séquençage du génome entier dun patient LAM (Illumina/Solexa) Ley et al., Nature, 2008 : Séquençage du génome entier dun patient LAM (Illumina/Solexa) nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultats Cependant, ces avancées posent de nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultats. Next Generation Sequencing (NGS)

31 31 IRON: The Interlaboratory RObustness of NGS Study Aims: To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep- sequencing analysis of hematological tumorsTo establish 454 technology as a robust methodology to perform deep- sequencing analysis of hematological tumors interlaboratory precision and accuracyTo evaluate 454 technology in terms of interlaboratory precision and accuracy Testing of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratoriesTesting of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratories Sample processing including MIDs using the MLL-designed Assay-on-demand plates (96-well) and Titanium Amplicon chemistry Establish a 454 Hematology Focus group Publish consensus guidelines on QC and assay robustnessPublish consensus guidelines on QC and assay robustness

32 32 IRON Study: Participants and laboratories Austria GB Belgium Germany Italy Austria USA Spain Nether- lands Italy Dr. Gabriel, Blood Bank, Linz Dr. Garicochea, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre Dr. Simen, 454 Life Sciences, Branford Prof. Vandenberghe, UZ Leuven, Belgium Prof. Martinelli, University of Bologna Dr. JH Jansen, Radboud University Medical Centre, Nijmegen Switzer- land Brazil Italy Prof. Haferlach, Münchner Leukämie Labor, München Dr. Timmermann, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin Dr. te Kronnie, Università degli studi di Padova, Padova Prof. Young, St. Bartholomews, London

33 33 Classification morphologique des hémopathies (FAB, WHO, WF) Classification cytogénétique des hémopathies (LAL, LAM, LNH) Classification moléculaire des hémopathies (LAL, LAM, DLBCL) Transcriptomique

34 34 Classification moléculaire des Lymphomes Alizadeh et al., Nature 2000;403:503 DLBCL de ladulte puce cDNA

35 35 Classification moléculaire des Lymphomes Wright et al., PNAS 2003;100: DLBCL puce cDNA

36 36 - Clustering à partir des 40 top gènes identifiant chaque catégorie. - Pas didentification des ss-classes B. - 20% des LAL restent inclassables. - 70% des gènes identifiant les HD sont sur lX ou le 21 (indépdt de +X ou non). - 4 cas classés dans TEL-AML1, sans t(12;21) Tous anormaux pour TEL. Yeoh et al., Cancer Cell 2002;1: LAL pédiatriques puce Affymetrix

37 37 Comparaison LAL / LAM

38 38 Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41 Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41. Nouvelles cibles thérapeutiques

39 39 COST:European COoperation in the field of Scientific and Technical research Kick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ans

40 40 Chair: K. Mills Chair: L. Bullinger Chair: S. Raynaud Chair: S. Lehman Chair: RA Padua Chair: M. Dugas 17 pays européens


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