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Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA Paris le 7 novembre 2008.

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1 Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA Paris le 7 novembre 2008

2 Génotypage rhésus D fœtal Conflits dintérêts déclarés JM Costa Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®RhD): aucun

3 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel LADN fœtal sérique ou plasmatique (ADN fœtal libre circulant) Cellules fœtales circulantes

4 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel ADN fœtal libre: difficultés et limites danalyse Ne représente que 3 à 6% de lADN plasmatique Analyse restreinte aux séquences « paternelles »

5 Analyse de lADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif Phénotype RhD-positif 85% Phénotype RhD-négatif 15% + + del + 43% 42%

6 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Génome paternel RhD-positif Sang maternel Fœtus RhD-négatif Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-positif Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (dorigine paternelle) dérivées du gène RHD Génome maternel + Génome foetal Ex5 Ex7 Ex10

7 Les bases moléculaires du système rhésus Allèle RHD+ Allèle RHD Neg « classique » Allèle RHD- « RHD » Allèle RHD- « RHD-CE-D s » Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Ex5 Ex7 Ex10 <1% 18%99% Afrique noireCaucase 15% 67% 3-5% 15-17% Fréquence du phénotype RhD-négatif: Sensibilité

8 Génome paternel RhD-positif Sang maternel Les limites Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus FAUX-Positif Ex5 Ex7 Ex10

9 Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Génome paternel RhD-positif Sang maternel Fœtus ? « Unconclusive result » Les limites Génome maternel + Génome foetal Ex5 Ex7 Ex10

10 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites: aucun test ne sera jamais parfait Les « unconclusive results » variants du gène RHD chez la mère Les faux-positifs variants du gène RHD chez le foetus Procédure de laboratoire (contaminations) Vanishing twin Les faux-négatifs Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité) variants du gène RHD Allo-immunisation 13% Injection inutile anti-D Risque infectieux 0 (?)

11 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Expériences récentes en Europe

12 Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHD fœtal ? Recommandation du CNOGF 2005 Intérêts Cà marche ! Limiter lexposition à des produits dérivés du sang Limiter lutilisation des immunoglobulines (stocks limités) Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111: ) Pour éviter 1 cas dallo-immunisation, il faut traiter: –278 femmes en labsence de génotypage –166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

13 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Frein à sa généralisation Déficit dinformation des patientes et des professionnels Laboratoires –Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Autorisation de diagnostic prénatal par lARH Praticiens agréés par lAgence de la Biomédecine Coût du test –Remboursement (B700: 189 par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier2008 (décision CNAM unilatérale) –Sanquin-NL (149), Pasteur-Cerba-FR (150), IGBRL-UK (279) –Haute Autorité de Santé saisie début 2008 –Intérêt économique incertain

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15 Intérêt économique du génotypage RHD foetal systématique? Etude pilote: A.Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris Suivi de 101 patientes RhD négatives (Caucase.93, Afr.Nord7, Antilles 1) –Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre: terme moyen 13SA –Pas de prophylaxie systématique à 28SA –Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers Résultats –Génotypage RHD fœtal –2 résultats « unconclusive » (Caucase1,Antilles1) –75 patientes à risque (fœtus RHD-positif) –24 patientes avec fœtus RHD-négatif ( 25%) –Prophylaxie ciblée: 23 patientes –12 amniocentèses –11 saignements et traumatismes

16 NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 2 Prévention ciblée+systématique NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 1 Prévention ciblée 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique Conjoint (à documenter) Détermination du groupe rhésus Coût moyen par patiente: 331 (+36.8%) Coût moyen par patiente: 242 Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématique

17 NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique Génotypage RHD foetal X Test commercial RHD en duplicate Prévention ciblée+systématique 1 Prévention ciblée Coût moyen par patiente: 331 (+36.8%) Coût moyen par patiente: 242 Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 22/test 464 si génotypage 150/test 599 si génotypage 279/test A titre de repère Test de Kleihauer 19 PCR Chlamydia UR 27 PCR Toxo LAMN 169

18 Quelle stratégie? NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique Génotypage RHD foetal X Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 46/test 440 si génotypage 150/test 574 si génotypage 279/test 2 Prévention ciblée+systématique 1 Prévention ciblée Coût moyen par patiente: 331 (+36.8%) Coût moyen par patiente: 242 X Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 22/test 464 si génotypage 150/test 599 si génotypage 279/test

19 Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X X Génotypage RHD foetal X 2 Prévention ciblée+systématique 1 Prévention ciblée Coût moyen par patiente: 331 (+36.8%) Coût moyen par patiente: 242 Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 87/test 399 si génotypage 150/test 532 si génotypage 279/test Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 22/test 464 si génotypage 150/test 599 si génotypage 279/test

20 NNé RhD-Positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif NNé RhD-négatif Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche dagglutinines irrégulières Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Anti-D 200µg Test de Kleihauer 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X X Génotypage RHD foetal X 2 Prévention ciblée+systématique 1 Prévention ciblée Coût moyen par patiente: 331 (+36.8%) Coût moyen par patiente: 242 Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 110/test 370 si génotypage 150/test 501 si génotypage 279/test Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 87/test 399 si génotypage 150/test 532 si génotypage 279/test Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 155/test 319 si génotypage 150/test 453 si génotypage 279/test 33% 50% 25% Taux de Fœtus RHD Neg Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? Coût moyen par patiente: 331 si génotypage 22/test 464 si génotypage 150/test 599 si génotypage 279/test

21 Peut-on réduire la demande de génotypage? Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B75:25) del Fœtus RhD-positif 50% Fœtus RhD-positif 100%

22 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Questions à réponses variables ADN fœtal sérique ou plasmatique? Quel délai pour lacheminement de léchantillon au laboratoire? Quel test proposé:1ère, 2ème ou 3ème génération? Doit-on contrôler les résultats négatifs? Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse? A quel terme? A quelle patiente doit-on proposer le test? –Patientes allo-immunisées –Patientes devant avoir un geste invasif –Toutes les patientes RhD négatives

23 Test de Kleihauer: contrôle de qualité Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001 échantillon C: 50 hématies fœtales/ Nbre dinjections anti-D 23451


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