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PCR en temps réel (PCR quantitative). But 1.Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle 2.Comprendre les.

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1 PCR en temps réel (PCR quantitative)

2 But 1.Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle 2.Comprendre les calculs de base pour la quantification avec la PCR en temps réel 3.Comprendre les differences entre la PCR en temps réel et le transfert Northern

3 Applications de la PCR en temps réel Méthode quantitative puissante – Expression génique – Détermination/suivi de la charge virale – Quantification de gènes cancerigène – Vérification de biopuce – Vérification de transgène – Analyses de SNP

4 Trois phases Phase linéaire Plateau Phase exponentielle Nombre de cycles Quantité de produit de PCR Étapes de la PCR en temps réel

5 X n = X 0 * (1 + E) n E = [10 (–1/pente) ] – 1 (Efficacité = 1 dans la phase exponentielle) Amplification exponentielle X n = Copies dADN au cycle n X 0 = Copies dADN au cycle 0 E = Efficacité damplification n = Nombre de cycles

6 Détection de la fluorescence Deux types de fluorochromes – Ceux qui se lient à lADN double brin – Sondes à ADN avec fluorochrome Système de détection quantitatif

7 SYBR green (Lie lADN double brin) Plus commun SYBR green

8 Sondes avec fluorochromes (FAM, VIC, TET, FRET) Fluorochrome Atténuateur Moins commun

9 Ne discrimine entre le gène dinterêt et dautres ADN (e.g. contamination) Ne permet pas la PCR multiplex Moins détapes requises Moins coûteux Discrimine, plus spécifique Permet la PCR multiplex avec usage of different fluoro. Requiert moins détapes Plux coûteux SYBR green Sondes avec fluoro. Vs.

10 Zones de détection PCR en temps réel vs PCR trad. PCR traditionnelle EtBr PCR en temps réel Nombre de cycles Quantité de produit de PCR

11 Augmentation de la fluorescence est proportionnelle à lamplification dADN Le premier cycle auquel linstrument peut déterminer laugmentation de fluorescence comme étant au dessus du bruit de fond est le cycle seuil Ct (threshold cycle) Quantification de lamplicon de PCR en temps réel

12 Le cycle seuil (Ct) Ct Exemple de Ct

13 Ct de trois différents échantillons Le cycle seuil (Ct)

14 Le Ct est inversement proportionnel à la concentration initiale dun échantillon – e.g. Plus la concentration dADN est grande plus la valeur du Ct est petite Le cycle seuil (Ct)

15 1.Quantification absolue – Pour déterminer la quantité exacte dADN (e.g. charge virale) 2.Quantification relative – Pour déterminer le changement dexpression génique Méthodes quantitatives

16 Si la quantité initiale dDNA est connue: X T = X 0 * (1 + E) Ct Si non, les Ct des échantillons doivent être comparés à ceux dune courbe détalon Quantification absolue X T = quantité dADN au cycle seuil X 0 = quantité dADN au cycle 0 E = efficacité damplification Ct = cycle seuil

17 Quantification absolue Echantillon du gène Mel1 dont le Ct après amplification est 22.5 cycles. Quelle est la concentration de lamplicon?

18 22.5 = x Concentration de lamplicon de Mel1 Ct de 22.5 x = La concentration dADN est µg/ml (Log inverse de 10) y = x Quantification absolue

19 Normaliser le gène dinterêt à un gène domestique Échantillon Gène domestique Rapport Quantification relative

20 Plus sensible (besoin ~50 ng dADN) Plus précis (peut déterminer n o copies) Matrice dADN (stable) Ne donne pas la taille des transcrits Plus rapide (juste quelques heures) Moins détapes impliquées Moins sensible (besoin de ~10 ug dADN) Moins précis (ne peut pas déterminer n o copies) Matrice dARN (instable) Donne la taille des transcrits Long (Plusieurs heures à jours) Beaucoup détapes impliquées PCR en temps réel Transfert northern Vs.


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