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Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION.

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1 Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

2 ADN patient *Cy3 ADN témoin *Cy5 Cohybridation Lavage Lecture par scanner Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté Marquage des ADN Principe de la CGH array

3 Wolf- Hirschhorn Cri du Chat Williams- Beuren Langer- Giedion Prader-Willi / Angelman Miller- Dieker Smith- Magenis DiGeorge Y X

4 Quelle technologie utilise Prenatal BoBs? BACs on Beads utilise le couplage de sondes dADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région. PrenatalBoBs ACs n ead

5 Random Primer Solution Biotin-dNTP Mix Polymerase Sample Diluent Marquage de lADN à la Biotine Biotine J1

6 Purification de lADN Kit de purification Purelink INVITROGEN Biotine Colonne avec filtre

7 Hybridation de lADN sur les billes Biotine Sonde fixée sur les micro billes Hybridation à 52°C à 1200 rpm 16 à 20H Dénaturation 5 mn à 85°C

8 Wash Buffer 1 Lavages Elimination de lADN non hybridé ADN marqué non-hybridé Filtre 0,45 µm en µplaque J2

9 Reporter Concentrate Reporter Diluent Révélation du signal Biotine Streptavidine Phycoérythrine 37°C 1200 rpm

10 Wash Buffer 2 Lavages Filtre 0,45 µm en µplaque Streptavidine non couplée

11 Lectures des billes Lecture dune plaque complète = 2h

12 Lectures des billes Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur lADN Le laser rouge identifie le signal de la bille

13 Profil féminin normal

14 Profil masculin anormal

15 Notre expérience à Robert Debré

16

17 BACs on Beads utilise le couplage de sondes dADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

18 Nos résultats De avril 2011 à juillet 2012

19 Intérêts –Rendu de résultats rapide –Seulement ? ng dADN nécessaire soit 2mL de LA ou 1 petite villosité –Comparaison avec des références mâles et femelles –Jusquà 44 patients par plaque –Jusquà 100 sondes par puits dont 4 à 8 sondes par région étudiée –Screening plus large (dont contrôles sur quelques autosomes)

20 Exemple dune découverte dune tétrasomie 12p chez un fœtus

21 Exemple dune découverte dune délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un RCIU à 34SA

22 Inconvénients –Non détection des translocations équilibrées ? –Difficulté dinterprétation des triploïdies –Technique très manuelle –Technique coûteuse ? –Certaines microdel étudiées inutiles ?

23 Exemple dune triploïdie chez un fœtus


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