LES SONDES Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED 1.

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1 LES SONDES Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED 1

2 LES SONDES I – Définition II - Les différents types de sondes
- les sondes ADN génomique - les sondes cDNA - les oligosondes - les ribosondes III- Obtention des sondes - clonage - PCR IV – Marquage des sondes

3 Définition * Sonde : Séquence nucléotidique, généralement marquée, complémentaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN avec laquelle elle va s'hybrider. * Sondes directes : exploration d'un gène ou d'une région génique dont on a déjà quelques informations. * Sondes indirectes ou sondes anonymes : exploration de gènes peu ou pas connus

4 Obtention des sondes AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO : PCR OBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN) OUTILS : - 2 amorces (= oligonucléotides) - ADNpol - Substrats : dXTP PRINCIPE : Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADN à amplifier, on synthétise une très grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles.

5 PRINCIPE 1) DENATURATION : séparation des brins par augmentation de la température (95°C environ) 2) HYBRIDATION des AMORCES avec les bornes de la région à amplifier. (50°C environ) NB : la température doit être diminuée pour que l’hybridation est lieue. 3) SYNTHESE : l’ADNpol synthétise de l’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double la quantité initiale. (70°C environ) Fin du Cycle Après n cycles, on obtient 2n nouveaux exemplaires du fragment d’ADN

6 RESULTATS Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ?
2 copies avec les extrémités 3’ variables. Qu’obtient-on au bout du 2ème cycle ? 8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixes

7 LIMITES et APPLICATIONS
- Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inferieure à 2 kb) - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce) - ADNpol thermorésistante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque d’erreur. Amplification parasite : mauvaise hybridation et contamination APPLICATIONS : - Génération des sondes - Recherche de mutations - RT-PCR : étude des ARN - Clonage - PCR quantitative PCR en temps réel : quantification précise

8 Marquage des sondes 1 - l’agent de marquage : - marquage radioactif
- marquage froid - direct – nucléotide modifié par un fluorophore - indirect – nucléotide marqué par un reporter qui sera repéré par une molécule affine 2 – stratégies de marquage - nick translation - multi-amorçage au hasard - marquage des oligonucléotides

9 Les sondes radioactives
32P, 35S, 3H Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients : 1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des sondes inconfortable 2. décroissance rapide du 32P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment Avantage : grande sensibilité

10 Marquage direct avec un fluorophore
Les sondes froides Marquage direct avec un fluorophore Le nucléotide portant le marqueur est incorporé directement. Groupe chimique qui fluoresce quand il est exposé à une longueur d’onde donnée: Fluorescéine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red, TAMRA, TET.

11 Marquage indirect - digoxigénine - marquage par la biotine-streptavidine.

12 Marquage par Nick-translation
Endonucléase utilisée dans des conditions ménagées La DNAse génère quelques cassures aléatoires simple brin Au niveau des cassures la DNA polymérase I détruit l’ADN par son activité exonucléasique (5’-3’)…. … et le synthétise par son activité polymérase en Présence de nucléotides dont un est marqué

13 Marquage par random priming

14 MARQUAGE D’UN OLIGONUCLEOTIDE

15 • Hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN sur membrane
Différentes Applications • Hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN sur membrane • Sondes oligonucléotides • Séquençage • Hybridation in situ

16 Hybridation après électrophorèse
Southern blot : cible ADN et sonde ADN Hybridation après électrophorèse Southern blot : cible ADN et sonde ADN Northern blot : cible ARN et sonde ADN Western blot : cible protéine (antigène) et sonde protéine (anticorps)

17 MERCI POUR VOTRE ATTENTION