Bioingénierie de l’A.D.N.

Présentation au sujet: "Bioingénierie de l’A.D.N."— Transcription de la présentation:

1 Bioingénierie de l’A.D.N.
Semaine du 21 Septembre 2009 Outils du génie génétique 3. PCR CHMI 3216F – A2009

2 PCR Outil très puissant
Permet le synthèse in-vitro d’une molécule d’A.D.N. spécifique à partir de très faibles quantités. 3 étapes de base (1 cycle de PCR): Dénaturation de l’A.D.N. Hybridation d’amorces Synthèse d’un brin complémentaire par l’ A.D.N. polymérase CHMI 3216F – A2009

3 PCR L’augmentation dans la quantité d’ A.D.N. ainsi obtenue est exponentielle: double à chaque cycle (en théorie…..) L’augmentation de la quantité d’ A.D.N. suit la règle suivante: Augmentation = 2n n = nombre de cycles Donc, 25 cycles d’amplification par PCR permet d’obtenir, en théorie, une augmentation de la quantité d’ A.D.N. de 34 million de fois!!! En réalité, une augmentation de 2 fois par cycle est rarement obtenue, principalement à cause de facteurs limitant tels: La présence d’inhibiteurs Des régions riches en GC dans l’ A.D.N. gabarit. CHMI 3216F – A2009

4 PCR CHMI 3216F – A2009

5 PCR – Réactifs CHMI 3216F – A2009

6 Sélection des amorces CHMI 3216F – A2009

7 PCR CHMI 3216F – A2009

8 PCR CHMI 3216F – A2009

9 PCR Amorce 5’: 5’atg gac ggg tcc ggg gag cag ccc 3’ – BRIN CODANT
5’atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccca3’ 3’tacctgcccaggcccctcgtcgggtctccgccccccgggt5’ 95oC, 1 min 5’atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccca3’ 5’atggacgggtccggggagcagccc 3’ 3’tacctgcccaggcccctcgtcgggtctccgccccccgggt5’ CHMI 3216F – A2009

10 PCR CHMI 3216F – A2009

11 Amorce 3’: 5’acc atc tgg aag aag atg ggc tga3’ BRIN CODANT
3’tgg tag acc ttc ttc tac ccg act5’ BRIN NON-CODANT 5’ tca gcc cat ctt ctt cca gat ggt 3’ 5’ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctga3’ 3’gagtggcggagcgagtggtagaccttcttctacccgact5’ 95oC, 1 min 3’tggtagaccttcttctacccgact5’ 5’ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctga3’ 3’gagtggcggagcgagtggtagaccttcttctacccgact5’ CHMI 3216F – A2009

12 PCR CHMI 3216F – A2009

13 PCR Propriétés importantes des amorces: Longueur: 20-24 nt;
Point de fusion (Tm) = 50-70oC Tm= 2(A+T) +4(G+C) T hybridation = Tm-4oC %GC: 35%-65%; Bout 3’ riche en GC (agit comme point d’ancrage); Pas de séquences complémentaires entre deux amorces ou au sein d’une même amorce; Pas de pairage (même mineur) avec d’autres séquences d’A.D.N. non-reliés à l’ A.D.N. d’intérêt (vérification de la spécificité des amorces par Blast). CHMI 3216F – A2009

14 PCR-Température d’hybridation
55oC 50oC 1 2 3 Primer sets M 603 bp 310 bp 281 bp 234 bp 194 bp 118 bp CHMI 3216F – A2009

15 PCR – Fidélité de l’amplification
Amplification sans l’introduction de mutations dans la séquence d’A.D.N. synthétisé; Absence d’amplification de séquences homologues (apparentées) à la séquence cible. CHMI 3216F – A2009

16 PCR-amorces CHMI 3216F – A2009

17 PCR-nombre de cycles Quoique le rendement en produit amplifié augmente avec le nombre de cycles, on aura aussi en même temps la possibilité de: Amplification de séquences homologues; Introduction de mutations dans l’A.D.N. amplifié. CHMI 3216F – A2009

18 PCR-Effet du Mg+2 Mg2+ est un co-facteur pour toutes des A.D.N. polymérases Cependant, n’oublions pas que: Les amorces et les dNTPs lient le Mg2+ Trop de Mg2+ favorisera l’appariement non-spécifique des amorces; Donc: une concentration optimale de Mg2+ doit être établie pour chaque paire d’amorce. CHMI 3216F – A2009

19 PCR-Effet du Mg+2 Stoffel fragment: moins sensible à la chaleur et pas d’activité 5’3’ exonuclease. CHMI 3216F – A2009

20 PCR-Effet du Mg+2 CHMI 3216F – A2009
CHMI 3216F – A2009

21 PCR-Effet du Mg+2 http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p14.html
CHMI 3216F – A2009

22 PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009

23 PCR- A.D.N. polymérases Processivité: nombre de nucléotides polymérisés avant que l’A.D.N. pol ne quitte la molécule dA.D.N. cible. Fidélité: précision de l’enzyme (e.g. enzyme très fidèle: peu ou pas de mutations introduites dans l’A.D.N. amplifié). CHMI 3216F – A2009

24 PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009

25 PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009

26 PCR- A.D.N. polymérases IMPORTANT: Fidélité et rendement sont mutuellement exclusifs! CHMI 3216F – A2009

27 PCR- Effet plateau CHMI 3216F – A2009
CHMI 3216F – A2009

28 PCR- Effet plateau CHMI 3216F – A2009
CHMI 3216F – A2009

29 PCR- Effet plateau Effet plateau – diminution du taux d’accumulation (en théorie exponentiel) du produit de PCR. Peut être causé par: L ’épuisement des dNTPs L’épuisement des amorces Diminution de la stabilité des réactifs (p.ex. activité enzymatique; particulièrement à la température de dénaturation) Inhibition de la réaction par l’accumulation d’A.D.N. double brin; Compétition non-spécifique pour les réactifs (p.ex. lors de l’amplification non-spécifique d’A.D.N. homologue au brin cible) Hybridation des produits d’amplification l’un avec l’autre au lieu d’avec les amorces (particulièrement problématique lorsque la concentration en amplicon atteint des nivaux élevés). CHMI 3216F – A2009

30 Principal problème du PCR: la spécificité
CHMI 3216F – A2009

31 Augmenter la spécificité d’amplification Méthode “Hot Start”
CHMI 3216F – A2009

32 PCR-Spécificité CHMI 3216F – A2009

33 Augmenter la spécificité d’amplification Utilisation d’amorces “internes” (nested primers)
Utiliser deux paires d’amorces pour amplifier un fragment d’intérêt: La première paire d’amorce est utilisée pour obtenir un fragment plus grand de l’A.D.N. d’intérêt; Une seconde paire d’amorce, choisie à l’intérieur du premier fragment amplifié, est utilsée dans une seconde amplification par PCR. CHMI 3216F – A2009

34 Augmenter la spécificité du PCR Touchdown PCR
Dans le touchdown PCR, la réaction est tout d’abord faite à une température d’hybridation plus élevée de quelques degrés (p.ex. 5oC) de la température d’hybridation optimale des amorces; Pendant les premiers cycles, la température d’hybridation est progressivement diminuée (1oC par cycle); Le but est de favoriser l’amplification de l’A.D.N. d’intérêt pendant les tous premiers cycles, limitant l’amplification de produits non-spécifiques lors de cycles subséquents. CHMI 3216F – A2009

35 PCR- A.D.N. riche en GC Betaine + - CHMI 3216F – A2009

36 PCR vs clonage CHMI 3216F – A2009

37 CHMI 3216F – A2009

38 CHMI 3216F – A2009

39 CHMI 3216F – A2009

40 Devoir #4! CHMI 3216F – A2009