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Expression du Génome Le transcriptome. Déchiffrage de lInformation Génique Linformation est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des.

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1 Expression du Génome Le transcriptome

2 Déchiffrage de lInformation Génique Linformation est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes Linformation est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes Les gènes Les gènes Linformation contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines Linformation contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines

3 Les Gènes Site dinitiation de la transcription Séquence de terminaison 3 Promoteur/ Region régulatrice 5 Introns Transcrit dARN Region 5 nontraduite Region 3 nontraduite Exon 2Exon 3 Int. 2 Exon 1 Int. 1 Exons Seulement un des deux brins dun gène est codant!

4 Codant Brin Codant Brin Codant Brin positif Brin positif Brin sens Brin sens Brin complémentaire à la matrice Brin complémentaire à la matrice Brin dont la séquence est la même que celle de lARN transcrit Brin dont la séquence est la même que celle de lARN transcrit Brin sur lequel se retrouve le promoteur Brin sur lequel se retrouve le promoteur 4

5 Non Codant Brin non Codant Brin non Codant Brin négatif Brin négatif Brin anti sens Brin anti sens Brin matrice Brin matrice Brin dont la séquence est complémentaire à celle de lARN transcrit Brin dont la séquence est complémentaire à celle de lARN transcrit 5

6 Codant Vs Non-codant ADN: 5 TAG 3 3 ATC 5 Traduction Leu Protéine: Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt Transcription ARN: ?53

7 Génome Transcriptome Répertoire dARN des gènes qui codent pour des protéines Répertoire dARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée Protéome Répertoire de protéines dérivées du transcriptome Transcription Traduction

8 Un Génome Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules dun organisme? Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

9 Est-ce quune Séquence Code pour un Transcrit? Analyse dhybridations Northern : Analyse dhybridations Northern : RT-PCR RT-PCR 9

10 Comparaison des Méthodes 10 Northern RT-PCR Séquence doit être connue Présence ou absence dun transcrit Permets de déterminer la taille Sensibilité Comparer labondance relative Obtenir la séquence du transcrit Déterminer quel brin dADN est transcrit Déterminer combien de transcrits sont fait à partir dune séquence Non Oui Oui Oui Non Faible Élevée Oui Non Oui Oui Oui Non LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI

11 Analyse Northern Isoler lARN total de cellules ou dun tissu Isoler lARN total de cellules ou dun tissu Séparer les ARN daprès leurs grosseurs sur gel dagarose dénaturant Séparer les ARN daprès leurs grosseurs sur gel dagarose dénaturant Formaldéhyde + Formamide Formaldéhyde + Formamide Hybridation avec une sonde complémentaire Hybridation avec une sonde complémentaire ARNr ARNt

12 Hybridation Northern Nécessite une sonde Nécessite une sonde Hybridation = la sonde possède des séquences dun gène Hybridation = la sonde possède des séquences dun gène La séquence est exprimée La séquence est exprimée Intensité du signal dhybridation = abondance relative Intensité du signal dhybridation = abondance relative Nombre de signaux dhybridation = nombre de transcrit Nombre de signaux dhybridation = nombre de transcrit Possiblement nombre de gènes Possiblement nombre de gènes 12

13 Hybridation Northern Permet de comparer la quantité relative dun transcrit Permet de comparer la quantité relative dun transcrit Sensibilité faible Sensibilité faible Requiert un témoin interne Requiert un témoin interne Gène dont labondance est constante sous les différentes conditions examinées Gène dont labondance est constante sous les différentes conditions examinées –Témoin pour les variations de la quantité dARN chargé –Utilise des gènes domestiques : Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules Expression constitutive Expression constitutive 13

14 La Normalisation 14

15 Problème Un Northern dARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus Un Northern dARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus 15 Tissus: F C R P ActineFos

16 RT-PCR Permets damplifier une séquence dARN Permets damplifier une séquence dARN Isoler lARN total de cellules ou dun tissu Isoler lARN total de cellules ou dun tissu Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse Amplifier par PCR la séquence dintérêt Amplifier par PCR la séquence dintérêt 16

17 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Non-Spécifique 17 AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT Appariement damorce polyT Collection Collection dADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée AAAAAAA ARNm AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT AAAAAAA TTTT Transcription dADNc T.I.

18 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Spécifique 18 AAAAAAA Synthèse dADNc T.I. un ADN complémentaire à un ARNm dintérêt AAAAAAA Appariement dune amorce gène spécifique AAAAAAA

19 RT PCR 19 Collection dADNcADNc dARN dintérêt Analyse sur gel PCR avec des amorces spécifiques à une séquence dintérêt

20 RT-PCR La séquence doit être connue pour la conception damorces La séquence doit être connue pour la conception damorces Produit damplification = Produit damplification = Les séquences des amorces font partie dun gène Les séquences des amorces font partie dun gène La séquence est exprimée La séquence est exprimée Intensité du produit damplification = abondance relative Intensité du produit damplification = abondance relative La taille du produit damplification nest pas égale à la taille du transcrit La taille du produit damplification nest pas égale à la taille du transcrit 20


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