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I. Les méthode générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant dune pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes.

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2 I. Les méthode générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant dune pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fécaux II.3 Streptocoques fécaux II.4 Clostridium sulfito-réducteurs II.5 Bactériophage III. Recherche et dénobrement des germes pathogènes IV. Principaux maladies à transmission hydrique

3 Lobjectif de lanalyse bactériologique dune eaux nest pas deffectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles detre pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fécales. Lanalyse débute par lacte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes assurant labsence de contamination et la survie bactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodes générales dexamen bactériologique des eaux suivies des recherches de bactéries indicatrices de pollution et défficacitée de traitement puis des bactéries spécifiques pathogènes

4 Matériel de prélèvement : flacon en verre (borosilicaté de préférence) de 250 à 1000 ml. flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant. Appareils de prélèvement : Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement deau un puits, au centre dun cours deau, en profondeur dans un lac, on doit utiliser des appareils tel que le plongeur et la canne à prélèvement.

5 plongeur Canne à prélèvement

6 En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de léchantillon, agent neutralisant, qualité du matériel déchantillonnage…..) Lobjectif est dobtenir un échantillon aussi représentatif que possible de leau à examiner, sans contaminer ni modifié léchantillon. Des précautions doivent être prises à trois niveau: Le matériel de prélèvement Le mode de prélèvement Le transport la conservation des échantillon Mode de prélèvement

7 en milieu solide En milieu liquide Méthode par incorporation Méthode par étalement Méthode par filtration Méthode de détermination du nombre le plus probable (PPN)

8 Méthode par incorporation: Principe: Léchantillon deau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à lintérieur du milieu sont comptées.

9 Mode opératoire. 1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml) 3)faire un mouvement de rotation 2) Incorporer le milieu en surfusion Incuber Faire le dénombrement

10 Principe: Léchantillon deau à analyser est étaler à la Surface dun milieu gélose sans trace dhumidité: après incubation, les colonies qui se développent à la surface sont dénombrées.

11 Etaleur stérile (râteau) Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml Incuber Dénombrer les colonies développer à la surface

12 Principe: Léchantillon deau à analyser est filtré à Travers une membrane qui retient les micro organisme. La membrane est ensuite placée sur un milieu gélosé. Durant lincubation, des colonies se forment à la surface de la membrane

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14 Mode opératoire

15 Principe générale: Les prise dessais de léchantillon deau ou de ses Dilution sont incorporées dans un milieu liquide conçu Pour permettre la croissance dun micro-organisme ou de groupe de microorganismes. la croissance se traduit par lapparition dun trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible ( virage dun indicateur de pH coloré)

16 Principe: Cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organisme supposés distribués dans leau de manière parfaitement aléatoire. Lestimation de la densité bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilution successives de la suspension bactérienne originelle. Il sagit dune méthode quantique et non pas énumératif.

17 On ensemence des dilutions successives de leau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusquà 96 puits en cas de manipulation en micro plaque). On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence dau moins dun micro-organisme. Il doit être tenu compte que si labsence de culture correspond à labsence de micro- organisme, plus dun micro-organisme peut être responsable dune culture positive. Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).

18 Notion dindicateur comme lorigine de la plupart des micro-organismes pathogènes véhiculés par leau est fécale, le principe du contrôle de la qualité de leau repose sur la démonstration que leau distribuée ne contient pas de germes provenant de contamination fécale. Pour cela, on recherche des indicateurs de contamination fécale, appelés aussi germes témoins de contamination fécale. On parle également dindicateurs de traitement qui permettent dévaluer lefficacité des différents traitements De potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différents germes.

19 Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature : Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et lapparition dinfection dans une population. Ecologique : il doit être spécifique dune contamination fécale : systématiquement rencontré lorsquil y a présence de féces danimaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans leau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre. Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans leau. Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout.

20 Définition : On entend par microorganismes : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque lessai est effectué selon la méthode spécifiée. Le principe consiste à mettre en évidence les bactéries Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques de leau. Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes issus de lhomme et des animaux à sang chaud.

21 dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées. Dans lusine de potabilisation, il permet de contrôler lefficacité des différentes étapes du traitement. dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe dune multiplication bactérienne dans le réseau ou dune intrusion de bactéries à lintérieur de celui-ci. Dans les réservoirs et châteaux deau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de leau et sur la reviviscence des germes

22 Définitions: Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de dacide et de gaz en 48h à une température de °C. Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes dorigine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia. Les germes provenant dautre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena.

23 Intérêt: la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C :intéressant pour juger de lefficacité de la désinfection dune eau est dun intérêt moindre pour déceler une contamination fécale sure coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe lexistence quasi certaine de la contamination fécale. La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est lespèce la plus représentée dans la flore intestinale de lhomme et des animaux.

24 Définition : bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant lantigène D, cultivant en anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables dhydrolyser lesculine en présence de bile. Ils se répartissent en deux genres : streptococcus et enterococcus.

25 Intérêt: les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe dune contamination fécale de leau plus ancienne. La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale dune eau. Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans lenvironnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.

26 Définitions: Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices : formes de résistance de micro-organismes se développant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium. Spores de clostridium sulfitoréducteurs : même définition que la précédente pour des bacilles à Gram positif, ne possédant pas de catalase et ayant laspect morphologique des clostridium.

27 Intérêt: ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien queffectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste. Lintérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection. Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de lefficacité des traitements vis-à- vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.

28 analysetechniqueVolume de PE Milieu utilisé T dincubationconfirmation µ-organisme revivifiables Incorporatio n en milieu liquide 1 mlGélose à lextrait de levure 37° OU 20° C - Coliformes totaux filtration 100 mlGélose lactosée au TTC 37° CColonies typique OX- Coliformes fécaux filtration100 mlGélose lactosée au TTC 44° CColonies typique Streptocoque Du Gr D filtration100 mlGélose Slanetz et bartley 37° CColonies typiques +Litsky Colistridiums sulfito- réducteurs Incorporatio n en milieu solide 20 mlGélose tryptome sulfite à la D- cyclosérine 37 ° CColomies typique

29 IV.1 Recherche de salmonella Définition: Des bacille Gram négatifs (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques.

30 Pré-enrichissement Enrichissement primaire Enrichissement secondaire

31 Lecture et interprétation : Repérer les colonies caractéristiques. Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée - Indole, LDC… Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur lagglutination à laide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien sadresser au laboratoire de référence.

32 Définition: Bacille Gram négatif droits ou incurvés, Très mobiles, Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes.

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34 Définition: Cocci à Gram (+) Isolées ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. Lespèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée.

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36 Définition: Un bacille Gram négatif Oxydase (+) Capable de produire de lammoniac à partir de lacétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.

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