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LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON Peptone pancréatique de caséine2 g Extrait de levure1 g Chlorure de sodium5 g Phosphate monopotassique0,3 g Glucose10 g Bleu.

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1 LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON Peptone pancréatique de caséine2 g Extrait de levure1 g Chlorure de sodium5 g Phosphate monopotassique0,3 g Glucose10 g Bleu de Bromothymol0,03 g Agar (gélose)3 g EDqsp 1 L Composition Source de C et N Source de C à rajouter solidification du milieu gélose semi solide Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide Milieu aqueux pH = 7,2 Source de C, N, minéraux et vitamines Source de P Équilibre ionique

2 Technique d ensemencement 1- Régénérer le tube 20 minutes au bain marie bouillant 2- Ajouter le volume de solution de glucose stérile dans le milieu en surfusion: à 45°C 3- A jouter trois gouttes de suspension bactérienne et refroidir immédiatement le tube sous leau froide. 4- Ne pas visser le tube à fond 5- Incuber 24 heures à 37°C lecture Virage de lindicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide. Il y a eu production dacides lors de lutilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence dO 2. Les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose. Virage de lindicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide. Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d O 2. Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose. Le milieu reste tel quil était avant ensemencement. Il ny a pas de culture. Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose

3 Le milieu Citrate de Simmons Sulfate de magnésium0,2 g Phosphate monopotassique1 g Phosphate bipotassique1 g Citrate de sodium2 g NaCl5 g Bleu de Bromothymol0,08 g Agar (gélose)15 g EDqsp 1 L Composition Equilibre osmotique Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide pH = 6,8 Sources minérales Seule source de C 6 7,6 Ensemencement Faire une strie centrale avec une suspension en eau physiologique ou directement à partir dune colonie Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C

4 Milieu de Clark et Lubs Peptone trypsique ou polypeptone5 à 7 g Glucose5 g Phosphate bipotassique5 g EDqsp 1 L Composition Source de C pH = 7 Sources minérales Source minérale Ensemencement Ensemencer avec 5 à 10 gouttes de suspension bactérienne. Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C Test RM Après incubation, prélever 2 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 1 à 2 gouttes de rouge de méthyle. Observer. 4,5 6,8 Test VP Après incubation, prélever 1 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 0,5 mL d -naphtol et 0,5 mL de soude. Mélanger et incliner le tube. Faire la lecture après 10 à 15 min de contact.

5 Milieu de Kligler Hajna Extrait de viande de boeuf3 g Extrait de levure3 g Peptone20 g Chlorure de sodium5 g Citrate ferrique0,3 g Thiosulfate de sodium0,3 g Lactose10 g Glucose1 g Rouge de phénol0,05 g Agar (gélose)12 g EDqsp 1 L Source de C et N Composition Equilibre osmotique Mise en évidence de la formation H 1 S Source de soufre, témoin doxydo-rédcution Source glucidique majoritaire Source glucidique minoritaire Indicateur de pH 6,5 8,2 pH = 7,4 Ensemencement 2) Piqûre centrale dans le culot Fil droit ou pipette boutonnée 1) Stries serrées sur la pente Öse ou pipette boutonnée

6 Milieu mannitol mobilité nitraté peptone20 g Nitrate de potassium2 g Mannitol2 g Rouge de phénol à 1 %4 mL gélose4 g EDqsp 1 L Composition Source de C pH = 8 Sources de C et N Indicateur de pH Ensemencement Apport de nitrates Piqûre centrale avec le fil droit

7 Lecture des milieux Citrate de Simmons 1ère lecture possible Le milieu ne présente aucune culture. Les bactéries nutilisent pas le citrate comme source de carbone : CITRATE - 2nde lecture possible Le milieu présente une culture, lindicateur de pH a viré au bleu le milieu est devenu basique. Les bactéries ont utilisé le citrate comme source de carbone en produisant des composés alcalinisant le milieu: CITRATE +

8 Clarck et Lubs 1ère lecture possible Le milieu est devenu rouge le pH est acide. Il y a eu formation de composés acides par les bactéries au cours de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie des acides mixtes : RM +. 2nde lecture possible 1- Test RM Le milieu est devenu jaune le pH est basique. Les bactéries n utilisent pas la voie des acides mixtes lors de la fermentation du glucose : RM Test VP 1ère lecture possible 2nde lecture possible Formation dune coloration rouge en surface. Il y a formation dacétoïne et de butanediol dans le milieu lors de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie du butanediol : VP +. Pas de modification du milieu. Les bactéries nutilisent pas la voie du butanediol lors de la fermentation du glucose : VP -.

9 Mannitol mobilité 1ère lecture possible Le milieu est resté rouge le pH est neutre ou basique. Les bactéries ne fermentent pas le mannitol : MANNITOL -. 2nde lecture possible 1- Utilisation du mannitol Le milieu est devenu jaune le pH est acide. Les bactéries fermentent le mannitol et produisent des acides qui acidifient le milieu : MANNITOL Mobilité 1ère lecture possible Observation dune culture dans tout le tube. Les bactéries ont diffusé dans tout le milieu : elles sont MOBILES. Culture uniquement au niveau de la piqûre centrale. Les bactéries sont IMMOBILES. 2nde lecture possible

10 Kligler Hajna 1- lecture de la production dH 2 S Précipité noir de sulfure ferrique Production dH 2 S par les bactéries ! H 2 S+ Pas de précipité noir bactéries ! H 2 S- 2- lecture de la production de gaz Présence de bulles dans la gélose Les bactéries produisent du gaz (H 2 ou CO 2 ) au cours de leur fermentation : GAZ + Pas de bulle dans la gélose bactéries ! GAZ -

11 3- Lecture de lutilisation du lactose Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE + Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + Le milieu reste orangé. Les bactéries nutilisent pas le glucose et le lactose. GLC - et LAC - Pente jaune Culot rouge Acidification du milieu en aérobiose lors de lutilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif

12 Recherche de la -galactosidase Elle seffectue sur un tube de Kligler LAC - 1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente 2) Ajouter stérilement un disque ONPG 3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes 1) Le tube reste incolore. absence de la -galactosidase : ONPG - 2) La suspension est colorée en jaune présence de la - galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase.

13 Kligler Hajna 1- lecture de la production dH 2 S Précipité noir de sulfure ferrique Production dH 2 S par les bactéries ! H 2 S+ Pas de précipité noir bactéries ! H 2 S- 2- lecture de la production de gaz Présence de bulles dans la gélose Les bactéries produisent du gaz (H 2 ou CO 2 a)u cours de leur fermentation : GAZ + Pas de bulle dans la gélose bactéries ! GAZ - 3- Lecture de lutilisation du lactose Pente rouge Culot jaune Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE + Tube jaune Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + Tube orange GLC - et LAC - Pente jaune Acidification du milieu en aérobiose lors de lutilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif Culot rouge


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