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GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation.

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1 GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation

2 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à lemploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin didentifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté

3 1- GALERIE API 20E : son ensemencement

4 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à lemploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin didentifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés. La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté

5 2- Préparation de linoculum Prélèvement dune souche pure sur GNI 1 seule colonie sur GO 5 mL deau distillée stérile isolement Souche pure sur GNI 5 mL deau distillée stérile Préparation de linoculum pour ensemencer la galerie API 20 E

6 3- Ensemencement de la galerie API 20 E Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à laide dune pipette Pasteur stérile ouverte, pointe appuyée à lintérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles Pour certains caractères: Remplir le tube de suspension puis Recouvrir dhuile de paraffine Pour les tests : ADH, LDC, ODC, H 2 S, URE Ensemencement de la galerie API 20E Remplir de suspension le tube et la cupule Pour les tests : CIT VP GEL

7 2- GALERIE API 20E : sa lecture

8 2-1- Les réactifs à ajouter pour la lecture

9 4- Lecture de la galerie API 20 E Après 24h dincubation à 37°C, cupules ans lesquelles on doit rajouter des réactifs Napht-1-ol Naphtyl-1- amine Chlorure de fer III

10 2-2- Aspect des résultats positifs et négatifs

11 4- Lecture de la galerie API 20 E Les 10 premiers tests + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2 + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2 Tests négatifs Tests positifs après ajout des réactifs utiles

12 Tests négatifs Tests positifs Après ajout des réactifs Nit 1 et Nit 2 : lecture de la NR (ici NR +) Les 10 derniers tests

13 2-3- Explication des résultats positifs

14 ONPG Mise en évidence de la béta-galactosidase Substrat : ONPG Réaction : ONPG + eau Galactose + orthonitrophénol jaune

15 ADH, LDC, ODC Mise en évidence de : - l'arginine désaminase - lysine décarboxylase - ornithine décarboxylase Substrats : - arginine (dans ADH), - lysine (dans LDC) - ornithine (dans ODC) Réactions : dégradations libérant des produits basiques Révélateur : rouge de phénol Rouge/Rose = + Jaune/Orangé = - Rouge/Orangé = + Jaune = -

16 Citrate Mise en évidence de la dégradation du citrate comme seule source de carbone. Réaction : dégradation consommant des H+, donc responsable dune alcalinisation. Substrat : citrate Révélateur : BBT

17 Mise en évidence de production de sulfure Substrat : thiosulfate de sodium Révélateur : Fe 3+ Résultat positif : présence dun précipité noir de sulfure de fer H2SH2S

18 Mise en évidence de la présence d'une uréase Substrat : urée Réaction : urée + eau CO2 + 2 NH3, doù alcalinisation. Révélateur : Rouge de phénol Lecture : attention un orange clair sera -, un orange foncé sera considéré comme + Urée

19 Mise en évidence d'une tryptophane désaminase Substrat : Tryptophane Produit obtenu : Acide indol pyruvique Révélateur : - Réactif ajouté : Chlorure de fer III donnant un produit marron foncé en présence dacide indol pyruvique TDA

20 Indole Mise en évidence d'une tryptophanase Substrat : Tryptophane Produit : Indole Révélateur : - Réactif ajouté : Kovacs (ou James)

21 Voges Proskauer Mise en évidence de la production d'acétoïne, de 2,3 butane diol et de butane dione Substrat : Pyruvate Révélateur : - Réactifs ajoutés : VP1 et VP2 (1- naphtol et KOH)

22 TABLEAU DE LECTURE DE LA GALERIE MINIATURISÉE API 20E MicrotubeSubstrat :Caractère recherché Révélateur Lecture directe ou indirecte Test (si nécessaire) Résultat - Résultat + ONPG ONPG = Ortho- Nitro-Phényl- Galactoside ADH LDC ODC Arginine Lysine Ornithine Rouge de phénol CITCitrate H2SH2S Thiosulfate de sodium Fe III URÉUrée TDATryptophane INDTryptophane VP Pyruvate de sodium GELGélatine Particules de charbon GLU à ARA = zymogramme Substrat carboné (glucide) NO 2 - / N 2 Nitrates (NO 3 - ) Béta galactosidase Lecture directe Arginine Dihydrolase Lysine Décarboxylase Ornithine Décarboxylase BBT Lecture directe Utilisation du citrate Production dH 2 S Uréase Rouge de Phénol Tryptophane désaminase Tryptophanase ou production dindole production dacétoïne (3-hydroxybutanone gélatinase Utilisation de substrats carbonés (glucides) Nitrate réductase BBT Lecture directe Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif chlorure de fer III Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif Kovacs Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de VP1 et VP2 Attendre 10 minutes Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de NIT1 et NIT2 et zinc éventuellement BBT

23 3- GALERIE API 20E : son interprétation (identification de la souche)

24 Validation et possibilité dinterprétation si : – Cupule Glu + – Ou 3 autres cupules au moins positives

25 Démarche didentification : - apporter la preuve que la bactérie appartient bien à la famille des Enterobacteriaceae (montrer quelle a les 7 caractères définissant la famille) - identifier le genre, voire lespèce : * approche dichotomique, ou utilisation de tableaux des caractères * codage API * approche probabiliste utilisant un logiciel informatique

26 Code n°: (55) Identification de la souche Se référer au catalogue pour identifier la souche à laide du code Lecture des résultats de la galerie : Résultats reportés sur la fiche didentification

27 5- Identification de la souche (suite)

28 Méthode didentification probabiliste (p340 DTK) Le nom du micro-organisme est obtenu par un calcul de probabilité A chaque caractère dun micro-organisme donné fait référence une probabilité dêtre + ou – La probabilité que ce soit un taxon donné correspond aux produits des probabilité attribué à chaque caractère (si + = % de positivité ou si - =100%-% de positivité) = Le logiciel classe tous les résultats pour donner le ou les taxons les plus probables.

29 typicité Indice de typicité : comparaison entre le profil trouvé et le profil réel de la souche


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