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Techniques de microscopie électronique en laboratoire de recherche Stage PAF-APBG 15 et 16 juin 2010 Université de Rouen Marie-Laure Follet-Gueye et Maïté

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Présentation au sujet: "Techniques de microscopie électronique en laboratoire de recherche Stage PAF-APBG 15 et 16 juin 2010 Université de Rouen Marie-Laure Follet-Gueye et Maïté"— Transcription de la présentation:

1 Techniques de microscopie électronique en laboratoire de recherche Stage PAF-APBG 15 et 16 juin 2010 Université de Rouen Marie-Laure Follet-Gueye et Maïté Vicré-Gibouin GlycoMEV Ce diaporama a été réalisé par Odile Mottet à partir de photos des stagiaires

2 Préparation déchantillons végétaux (racines de pois et de lin) pour la microscopie électronique à transmission (MET) Les étapes 1- Fixation chimique 2- Déshydratation 3- Inclusion en résine et polymérisation 4- Ultramicrotomie 5- Marquage et contraste Les racines de pois sont sectionnées en fragments de 1 à 2 mm de longueur

3 1- La fixation chimique Il sagit de fixer les constituants organiques des ultra structures par un produit interagissant chimiquement avec ceux-ci. (Etablissement de liaisons faibles, oxydations =>réticulation des protéines les rendant insolubles, inactivation des enzymes bloquant les réactions…). Le choix du fixateur est fonction des objectifs de létude : * Pour lobservation des ultra structures, une post-fixation à losmium suit la fixation * Pour effectuer la localisation cellulaire dune molécule par immuno cytochimie, les fixateurs choisis ne doivent pas altérer les épitopes sur lesquels se fixent les anticorps. Les fragments de racine sont placés dans des tubes Eppendorf (à droite) remplis de fixateur pour une durée dune heure. Après plusieurs rinçages, la post-fixation à losmium seffectue à lobscurité. Toutes ces manipulations se font sous hotte, avec des gants et tous les produits utilisés (très toxiques) sont récupérés dans des récipients particuliers.

4 2- La déshydratation Les échantillons sont placés dans des bains déthanol de concentration croissante. Leau doit être éliminée pour permettre un bonne polymérisation de la résine. 3. Linclusion dans une résine Les échantillons sont progressivement imprégnés de résine puis inclus dans une résine Epoxy disposée dans des moules. La polymérisation seffectue en une nuit à 60°C. Pour des études dimmunocytochimie, lemploi de résines de type LR White savère nécessaire pour préserver les épitopes. La polymérisation seffectue à froid et sous UV pour les épitopes de nature protéique. Un échantillon est positionné vers lextrémité de chaque futur bloc de résine.

5 Pointe racinaire

6 4- Lultramicrotomie Le bloc de résine est taillé afin de créer un zone en forme de pyramide tronquée au ras de léchantillon. Cest au niveau de cette zone que les coupes sont réalisées.

7 Microtome à couteau de verre permettant la réalisation de coupes semi-fines (de lordre de 500 nm)

8 Un couteau de verre : derrière le côté tranchant, un réservoir rempli deau accueille les coupes La surface de léchantillon enrésiné doit être orientée parallèlement au couteau. Il doit être ensuite minutieusement rapproché de celui-ci. Bloc de résine contenant léchantillon Couteau de verre Réservoir deau servant à récupérer les coupes

9 Les couteaux de verres sont fabriqués au laboratoire 1. Des plaques de verre carrées sont sectionnées sur une diagonale 2. Le tranchant est vérifié à la loupe 3. Un réservoir destiné à recueillir les coupes est confectionné à laide de papier adhésif et de vernis.

10 La réalisation de coupes semi-fines avec le microtome 1. La résine est positionnée et ensuite le bras du microtome est mis en mouvement avec la manivelle (main droite). 2. La coupe juste réalisée telle quelle apparaît au manipulateur dans les oculaires. coupe

11 3. Les coupes sont récupérées avec un cil collé à lextrémité dune pipette Pasteur en verre. 4. Les coupes sont déposées dans une goutte de poly-L-lysine permettant une meilleure adhésion. 5. Afin dobserver ces coupes au microscope optique, la goutte est évaporée sur une plaque chauffante. Les coupes sont ensuite colorées au bleu de toluidine, puis rincées et séchées à nouveau. coupe Poly-lysine

12 Une coupe semi fine observée au microscope optique. Ici il sagit dune coupe de caryopse de blé dont on peut repérer la couche à aleurone, les téguments et lalbumen. couche à aleurone albumen téguments

13 Les échantillons enrésinés peuvent être coupés à lultramicrotome pour donner des coupes ultrafines (80 nm dépaisseur). La récupération des coupes avec une anse de platine permet de les déposer ensuite sur des grilles. Le couteau est en diamant. Lépaisseur des coupes est choisie et les coupes se font de façon automatique Les coupes telles que les observe le manipulateur dans les oculaires. Coupes Grilles en cuivre présentant un maillage sur lequel est déposée la coupe ultra-fine Anse de platine

14 5- Marquage et contraste 5A. Marquage par immunofluorescence: étape nécessaire au repérage des zones à analyser ensuite à léchelle subcellulaire (MET) Ces lames à puits en téflon contiennent des coupes semi fines de racine de pois de 0,5µm dépaisseur. Ces coupes sont successivement mises en présence : - de tampon TBST, lait à 3% destiné à saturer les sites non spécifiques, - danticorps primaires JIM5 ou JIM7. Ces anticorps sont des anticorps monoclonaux de rat dirigés contre les homogalacturonanes constituants des pectines pariétales. - danticorps secondaires, anticorps de chèvre anti-IgG de rat, couplés au fluorescéine Iso Thio Cyanate (FITC, molécule fluorescente) Les lames à puits sont recouvertes dune lamelle scellées par du vernis.

15 5.B. Immunomarquage à lor (pour observation au MET) Ces grilles Nickel portent des coupes ultrafines de racines de pois de 80 nm dépaisseur. Les grilles sont placées successivement au contact de gouttes contenant : - un sérum de chèvre destiné à saturer les sites non spécifiques -danticorps primaires (les mêmes que pour limmunofluorescence) - danticorps secondaires porteurs dune particule dor (10nm) opaques aux électrons. Le contraste (acétate duranyle puis citrate de plomb) est ensuite réalisé.

16 Les grilles sont les supports qui (après éventuellement immunomarquage) sont placés dans le microscope électronique à transmission. Grille portant les coupes placée dans le support à insérer dans le microscope. Portoirs de grilles Canon à électrons Condenseur Colonne sous vide contenant les lentilles électromagnétiques Caméra CCD Porte- échantillon Ecran sur lequel se forme limage Image numérisée Écran de contrôle du microscope

17 Vue générale de cellules de racine GlycoMEV

18 Statolithes (grains damidon) dans une cellule de la coiffe GlycoMEV

19 Détails de cellules de la coiffe GlycoMEV

20 Paroi végétale GlycoMEV

21 Appareil de Golgi GlycoMEV

22 Des polysomes GlycoMEV

23 Mitochondrie et paroi. Ici lorganisation fibreuse (microfibrilles de cellulose) de la paroi est visible. GlycoMEV

24 Un exemple dimmunomarquage avec fluorescence (avec anticorps JM5) des homogalacturonanes de la pectine pariétale (observation en microscopie optique à fluorescence) ( ici une préparation dans un bouton floral dArabidopsis) Source :

25 Résultats de limmunomarquage à lor des homogalacturonanes de la pectine pariétale Les petites taches très sombres correspondent aux particules dor fixées sur les anticorps secondaires eux-mêmes fixés sur les anticorps primaires. On peut ainsi localiser les molécules entrant dans la composition de la pectine.. paroiparticules dor GlycoMEV

26 Les molécules marquées sont repérables ici surtout au niveau de la lamelle moyenne GlycoMEV

27 Le marquage ici situé au niveau dun saccule golgien permet démettre lhypothèse de lintervention de lappareil de golgi dans la synthèse des composants de la pectine GlycoMEV


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