Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs Elodie Laine Dr. Thérèse.

Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs Elodie Laine Dr. Thérèse Malliavin Dr. Arnaud Blondel Ecole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie Curie Unité de Bioinformatique Structurale, Institut Pasteur (M. Nilges)

Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Contexte biologique La bactérie Gram+ Bacillus anthracis est l’agent pathogène du charbon (anthrax). 3 formes de contamination cutanée (plaie) intestinale (ingestion) pulmonaire (inhalation) Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Liddington et al. 2002 B. anthracis a la particularité de former des spores très résistantes, qui se propagent facilement dans l’air et dans l’eau (risque bioterroriste). Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Facteur oedémateux La virulence de B. anthracis est associée à : 1 capsule + 2 toxines (PA-EF/LF) Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion PA : antigène protecteur LF : facteur létal EF : facteur oedémateux Translocation Activation par CaM Production d’AMPc Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 3

Le complexe EF-CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Drum et al (1K8T) Drum et al (1K93) EF CaM EF-CaM + S1 S2 N-CaM Calmoduline Senseur du calcium 148 résidus, très flexible 2 lobes + 1 linker central S4 C-CaM S3 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Architecture du complexe Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hel N-CaM SC SB CB C-CaM CA SA Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Problématiques Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Questions biologiques : Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM rôle des ions calcium mécanismes de l’interaction protéique organisation du réseau de résidus Mobilité structurale de la protéine EF large transition conformationnelle relation avec la fonction enzymatique recherche rationnelle d’inhibiteurs de la toxine Méthodes : Simulations de dynamique moléculaire Détermination de chemin de réaction Criblage virtuel & validation expérimentale Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Plan Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Influence du calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Affinité de la calmoduline pour le calcium S2 S1 Ulmer et al. 2003 N-CaM Drum et al (1K93) C-CaM S4 S3 Le niveau de calcium influence la stabilité, voire la formation, du complexe EF-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Simulations DM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Simulations de dynamique moléculaire (DM) - 15 ns Superposition de 4Ca-CaM + phase d’équilibration sous contraintes 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca champ de force AMBER (ff99), thermostat de Berendsen, PME 0Ca 2Ca 4Ca Nombre de contre-ions 13 9 5 Dimensions de la boîte d’eau (Ǻ3) 123.9 x 81.9 x 99.2 Nombre de molécules d’eau (TIP3P) 24 632 24 642 24 652 Nombre total d’atomes 83 851 83 879 83 907 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Analyse de convergence - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Lyman & Zuckerman 2006 Sur l’ensemble de la trajectoire 1) conformation tirée au hasard 2) retrait des conformations à moins de r = 2.5 Å structures de référence 1ere moitié 2eme moitié Sur chaque moitié de trajectoire Chaque conformation est associée à la structure de référence la plus proche groupes de référence Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Dérive conformationnelle Déviation par rapport à la structure initiale Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Population des groupes de référence La trajectoire 1k93-2Ca présente la plus petite dérive conformationnelle et un bon critère de convergence. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Plasticité de CaM Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de CaM le long des trajectoires Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Plasticité de CaM Mode ACP de plus forte amplitude Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion - Ca2+ + Ca2+ 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca Les mouvements de CaM sont plus collectifs et plus indépendants avec 0 ou 4 Ca2+. CaM agit comme un ressort qui maintient EF en conformation ouverte active. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

La calmoduline et le calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion motif EF-hand Patchs hydophobes fermé ouvert Chatt. et al. 1992 Zhang et al. 1995 Chattopadyaya et al. 1992 Meador et al. 1992 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Coordination du calcium par CaM Nombre moyen d’atomes d’oxygène coordonnant les ions calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion (distance à l’ion Ca2+ < 2.8 Å) Asp 3 Asn 5 N-CaM C-CaM S1 S2 S3 S4 1k93-0Ca - 1k93-2Ca 5.7 5.6 1k93-4Ca 3.1 4.5 Asp 1 Tyr 7 Glu 12 Site canonique La coordination des ions calcium est incomplète dans N-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Changements conformationnels de CaM Ouverture des motifs EF-hands Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion N-CaM S1 (°) S2 (°) 1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5 1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3 1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7 θ θ C-CaM S3 (°) S4 (°) 1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3 1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8 1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6 L’interaction avec EF requiert que C-CaM soit ouvert, chargé de calcium, et bloque N-CaM en conformation fermée. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Structures cristallographiques Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1K93 1XFX (EF) Hel (EF) Hel (CaM) (CaM) S2 S1 S1 S2 Drum et al. 2002 Shen et al. 2005 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 18

Changements conformationnels de CaM Ouverture des motifs EF-hands Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion N-CaM S1 (°) S2 (°) 1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5 1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3 1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7 1xfx-4Ca 36.7 ± 4.1 55.3 ± 4.5 θ θ C-CaM S3 (°) S4 (°) 1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3 1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8 1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6 1xfx-4Ca 79.3 ± 2.9 95.4 ± 2.8 Mise en évidence d’une influence du réseau d’interactions entre EF et N-CaM sur l’ouverture des sites de fixation au calcium. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Distances au calcium dans les sites Glu 12 Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Asn 5 Asn 5 Glu 12 Asp 3 S1 EF contraint directement S1 dans les deux systèmes 1k93 et 1xfx. Le réseau plus dense d’interactions entre EF et N-CaM dans 1xfx contraint indirectement S2. S2 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Simulations LES «Locally enhanced sampling» : augmenter la probabilité de dissociation du calcium en utilisant plusieurs copies de l’ion. Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1k93 1xfx Copies 1 2 4 8 16 18 20 22 24 26 28 30 32 S1 P C 4D 7D 17D 29D 32D S2 P C 1D 4D 8D 19D S1 P C 6D 16D 9D 22D 32D S2 P C 10D 6D 29D 32D - CHARMM version 33b2 (200ps) - potentiel ligand-protéine réduit - fonction sigmoïdale diélectrique P : pas de dissociation C : dissociation commençante D : dissociation Leandro Martinez Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Calculs d’énergie libre Cycle thermodynamique de disparition du calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Intégration thermodynamique 1xfx 1xfx + ∆Gdiss(Ca2+/1xfx) (application d’une contrainte harmonique sur l’ion Ca2+) 1k93 1k93 + 1k93 ∆G (kcal/mol) S1 ± 0.54 S2 ± 0.67 ∆Gdiss(Ca2+/1k93) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Stabilité de la forme EF-(2Ca-CaM) en accord avec les données expérimentales Modèle de l’interaction EF-CaM exemple d’une conformation inhabituelle de CaM Influence mutuelle EF-CaM / Ca2+-CaM modulation par EF de l’affinité de CaM pour le calcium Données quantitatives de l’affinité de CaM pour le calcium calculs d’énergie libre (FEP, TI) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Architecture du complexe Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hel N-CaM SC SB CB C-CaM CA SA Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Modèle de réseau élastique Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Bahar et al. (1997), Fold. Des. Réseau élastique Les Cα distants de moins de 9 Ǻ sont connectés par des ressorts. Lindahl et al. (2006), Nucl. Acids Res. Simulations DM (Pearson) La méthode ENM prédit correctement les fluctuations thermiques (0.90 < R² < 0.99), mais ne permet pas de distinguer les différents niveaux de calcium. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Corrélations dynamiques - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Lange & Grubmüller (2006), Proteins Coefficient de corrélation généralisée Corrélations généralisées Information mutuelle Entropie de Shannon - mesure moins biaisée - rend compte des corrélations non linéaires Corrélations de Pearson Classification hiérarchique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Corrélations dynamiques
Fluctuations atomiques et groupes de résidus Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca 100 non corrélés (< 0.5) moyennement corrélés ( ) fortement corrélés (> 0.7) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Définition de pseudo-domaines Corrélations résiduelles de la méthode LFA Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion N C Hel SC SA CA CB Les corrélations LFA permettent de redéfinir des pseudo-domaines. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Influences énergétiques - méthode
Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Srinivasan et al. (1998), J. Am. Chem. Soc. Méthode MMPBSA Entropie conformationnelle Modes Normaux Mécanique moléculaire Eint + Evdw + Eele Interactions polaires de solvatation Poisson - Boltzmann Interactions non polaires de solvatation Surface Accessible Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Influences énergétiques - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hamacher et al. (2006), PloS Comput. Biol. Cartes de dépendances énergétiques Rang de réference Rangref Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X au reste du complexe. Rangref 6 7 2 3 5 4 1 Rang-Hel 4 6 1 3 - 5 2 CA CB SA SC Hel NCaM CCaM Rang relatif Rang-Y Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X‘ au complexe amputé du domaine Y. Si Rang-Y (X') moins bon que Rangref(X'), alors Y influence la stabilité de X' au sein du complexe. (intensité = nb de rangs perdus) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Influences énergétiques Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hiérarchie relative de stabilité des domaines au sein du complexe 1k93-2Ca : centrées, équilibrées 1k93-0Ca : perte d’influences 1k93-4Ca : plus diffuses * * * 1k93-2Ca * * * * * 1k93-0Ca 1k93-4Ca Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Connexité du réseau de résidus Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations c. Influences III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca * * * * * * * * Influences énergétiques & corrélations dynamiques La stabilité du complexe dépend de la connexité du réseau de résidus. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Architecture globale du complexe modèle de réseau élastique Dynamique globale et locale groupes de résidus et domaines dynamiques Connexité du réseau de résidus propagation de l’information Tests des modèles par l’expérience protéolyse, fluorescence, mutations Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Transition conformationnelle de EF Translation de 15 Å Rotation de 30° Boucle SB désordonnée Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Drum et al. 2002 (1K8T et 1K93) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Chemin d’activation de EF - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Détermination de chemin de réaction Arnaud Blondel Chemin : série de conformations qui ne sont séparées par aucune barrière énergétique. Fischer & Karplus (1992), Chem. Phys. Lett. Premier jet : Simulations DM orientées Cycle d’affinement : (i) réduction du nombre de conformations (ii) échantillonnage entre des paires de conformations, avec l’algorithme «Conjugate Peak Refinement» (CPR). Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Chemin de transition Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Analyse des mouvements de EF Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de EF le long du chemin Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Le chemin de transition de EF permet d’explorer des régions de l’espace conformationnel non atteignables par les simulations du complexe EF-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Identification de la poche Recherche systématique de poches Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 122 Å3 Lee et al. (2004) Chem Biol. Site catalytique 933 Å3 102 Å3 SABC 450 Ǻ3 223 Å3 ICM PocketFinder – Trotov & Abagyan (2004), Genome Inform. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Identification de la poche Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion conf 1 Switch C Stratégie : Sélectionner des molécules capables de se fixer sur la poche SABC dans la forme inactive de EF et de maintenir sa forme, bloquant ainsi l’activation. Switch B conf 8 Switch A conf 28 conf 47 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Outils de criblage virtuel
Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Rarey et al. (1996), J. Mol. Biol. FlexX Placement du fragment de base Reconstruction incrémentale Abagyan et al. (1994), J. Comput. Chem. ICM Configuration initiale Application du critère de Metropolis Rotation/Translation aléatoire Rotation/Translation aléatoire E0 E1 < E0 E2 > E0 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Approche in silico / in vitro
Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Criblage Virtuel Validation expérimentale Chimiothèque Nationale mol. 1. Elagage S < m -  3500 mol. meilleur 1% Conformations intermédiaires comme contrôles négatifs. Sélection des meilleurs ligands. Tests enzymatiques 18 composés testés 30% inhibent totalement l’activité de EF à des concentrations de µM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Tests enzymatiques CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion ATP EF + I activité enzymatique (1) I ATP CaM EF + activité enzymatique (2) (1) (2) CyaA F CH3-O diCl H Br Cl + - + + - Inhibiteurs de l’activité de EF (Ki ~ 2-3 µM) Christophe Goncalves, Johanna Karst Daniel Ladant Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Inhibition de CyaA Comparaison des structures de EF et CyaA Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Boucle SC / queue C-term Boucle SB / Boucle T300-K312 Boucle SA / Hélices F-G-H-H’ SABC de EF : 16 résidus 6 identiques, 5 similaires chez CyaA Guo et al. 2005 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Inhibition de EF-CaM Analyse des poches à la surface de EF le long des trajectoires DM du complexe EF-CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Poche résiduelle Å3 Site catalytique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Modélisation d’une transition complexe conformations intermédiaires plausibles Définition d’un site de liaison potentiel stratégie innovante : cibler une poche allostérique Identification d’inhibiteurs nouvelle famille de composés, affinités de quelques µM Caractérisation du mode de liaison des composés résolution d’une structure co-cristallisée Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Conclusion générale et perspectives Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM modèle de l’interaction EF-CaM influence mutuelle entre les interactions EF-CaM et Ca2+-CaM modèle de l’effet du calcium sur le réseau de résidus Mobilité structurale de la protéine EF chemin plausible de transition conformationnelle modulation de l’activité enzymatique par effet allostérique identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs Extrapolation à la toxine CyaA de B. pertussis caractéristiques différentes de EF mécanismes de l’activation par CaM déterminants de l’affinité des inhibiteurs Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Remerciements B I S Benjamin Bardiaux
Giacomo Bastianelli Aymeric Bernard Renée Communal Pak-Lee Chau Claire Colas Nathalie Duclert Julia Forman David Giganti Christophe Goncalves Tru Huynh Leandro Martínez (Brésil) Olivier Perin Edithe Selwa Edouard Yeramian Arnaud Blondel Thérèse Malliavin Michael Nilges Unité Biochimie des Interactions Macromoléculaires Alexandre Chenal Johanna Karst Daniel Ladant Universidade Federal Fluminense Julliane Yoneda B I S CERMN Aurélien Lesnard Sylvain Rault University of Chicago Wei-Jen Tang Claire Dane Gilles Vergnaud Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Equilibration 1k93-4Ca Distances de coordination du calcium dans S1 et S2 * : contraintes de distance de 10 kcal/mol/Å2 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Plasticité de EF Modes (1 et 2) PCA de EF Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Changements conformationnels de CaM Exposition des patches hydrophobes C C C N C N C N N N N C Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Réseau d’interactions EF-(N-CaM) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Réseau élastique et corrélation Matrice de Kirchhoff Fluctuations prédites Similarités entre matrices de corrélations Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Classification hiérarchique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Corrélations généralisées - classification Classification hiérarchique des résidus en fonction de leurs corrélations généralisées Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Dynamique locale - méthode
Zhang & Wriggers (2006), Proteins Analyse en composantes principales (ACP) Analyse locale des traits caractéristiques (LFA) Information par mode (globale) Réduction de dimensionalité (15 modes = % fluct.) Information par degré de liberté (locale) Réduction de dimensionalité ? algorithme de clairsemage Le formalisme LFA permet d’identifier des résidus « graines », autour desquels s’articulent des domaines dynamiques locaux. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Dynamique locale Polarisation du site catalytique autour de deux spots. Propagation du signal calcium le long de CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Test de Kolmogorov-Smirnov Test non paramétrique : pas d’hypothèse sur la nature des données Tester si deux échantillons sont issus de la même distribution H0 : les deux échantillons proviennent d’une même distribution H1 : les deux échantillons proviennent de distribution différentes P-value = probabilité d’observer les échantillons sous l’hypothèse nulle. Principe : comparaison des fonctions de répartition empiriques F(x) = P(X<x) = 1/n ∑ δxi<x Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Contributions MMPBSA Energies libres de liaison de référence 1k93-2Ca Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Contributions MMPBSA Différences d’énergies libres de liaison Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Caractéristiques du chemin Historique de l’affinement Chemin final Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Similarités de formes – ROCS Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Structural interaction fingerprints Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Robustesse de la poche Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs Elodie Laine Dr. Thérèse.

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