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Elodie Laine Dr. Thérèse Malliavin Dr. Arnaud Blondel Ecole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie Curie Unité de Bioinformatique Structurale, Institut.

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1 Elodie Laine Dr. Thérèse Malliavin Dr. Arnaud Blondel Ecole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie Curie Unité de Bioinformatique Structurale, Institut Pasteur (M. Nilges)

2 La bactérie Gram + Bacillus anthracis est lagent pathogène du charbon (anthrax). 3 formes de contamination cutanée (plaie) intestinale (ingestion) pulmonaire (inhalation) 2 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Contexte biologique B. anthracis a la particularité de former des spores très résistantes, qui se propagent facilement dans lair et dans leau (risque bioterroriste). Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Liddington et al. 2002

3 3 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 3 La virulence de B. anthracis est associée à : 1 capsule + 2 toxines (PA-EF/LF) Facteur oedémateux Activation par CaM Production dAMPc Translocation PA : antigène protecteur LF : facteur létal EF : facteur oedémateux

4 4 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Le complexe EF-CaM EF CaM EF-CaM + Drum et al (1K8T)Drum et al (1K93) Calmoduline Senseur du calcium 148 résidus, très flexible 2 lobes + 1 linker central N-CaM C-CaM S1 S2 S3 S4

5 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 5 Architecture du complexe Hel N-CaM C-CaM SC SB SA CA CB

6 6 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Questions biologiques : Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM rôle des ions calcium mécanismes de linteraction protéique organisation du réseau de résidus Mobilité structurale de la protéine EF large transition conformationnelle relation avec la fonction enzymatique recherche rationnelle dinhibiteurs de la toxine Méthodes : Simulations de dynamique moléculaire Détermination de chemin de réaction Criblage virtuel & validation expérimentale Problématiques

7 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion I. Stabilité de linteraction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs de EF a. Chemin dactivation de EF b. Définition dune poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques 7 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Plan

8 8 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Plan I. Stabilité de linteraction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs de EF a. Chemin dactivation de EF b. Définition dune poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques

9 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Influence du calcium S2S1 S4 S3 Drum et al (1K93) Ulmer et al Le niveau de calcium influence la stabilité, voire la formation, du complexe EF-CaM. Affinité de la calmoduline pour le calcium N-CaM C-CaM

10 10 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 1k93-0Ca Superposition de 4Ca-CaM + phase déquilibration sous contraintes 0Ca2Ca4Ca Nombre de contre-ions1395 Dimensions de la boîte deau (Ǻ 3 )123.9 x 81.9 x 99.2 Nombre de molécules deau (TIP3P) Nombre total datomes champ de force AMBER (ff99), thermostat de Berendsen, PME Simulations de dynamique moléculaire (DM) - 15 ns Simulations DM 1k93-2Ca1k93-4Ca

11 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 11 Analyse de convergence - méthode Lyman & Zuckerman 2006 Sur lensemble de la trajectoire 1) conformation tirée au hasard 2) retrait des conformations à moins de r = 2.5 Å structures de référence Sur chaque moitié de trajectoire Chaque conformation est associée à la structure de référence la plus proche groupes de référence ere moitié 2 eme moitié

12 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 12 Dérive conformationnelle Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Déviation par rapport à la structure initiale Population des groupes de référence La trajectoire 1k93-2Ca présente la plus petite dérive conformationnelle et un bon critère de convergence.

13 13 Plasticité de CaM Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de CaM le long des trajectoires Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

14 14 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion + Ca 2+ Les mouvements de CaM sont plus collectifs et plus indépendants avec 0 ou 4 Ca 2+. CaM agit comme un ressort qui maintient EF en conformation ouverte active. Plasticité de CaM - Ca 2+ Mode ACP de plus forte amplitude 1k93-0Ca 1k93-2Ca1k93-4Ca

15 15 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Chattopadyaya et al. 1992Zhang et al motif EF-hand La calmoduline et le calcium Patchs hydophobes Chatt. et al Meador et al ferméouvert

16 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Coordination du calcium par CaM N-CaMC-CaM S1S2S3S4 1k93-0Ca---- 1k93-2Ca k93-4Ca Nombre moyen datomes doxygène coordonnant les ions calcium La coordination des ions calcium est incomplète dans N-CaM. Asp 3 Asp 1 Asn 5 Tyr 7 Glu 12 Site canonique (distance à lion Ca 2+ < 2.8 Å)

17 N-CaM S1 (°)S2 (°) 1k93-0Ca33.4 ± ± 6.5 1k93-2Ca41.2 ± ± 7.3 1k93-4Ca43.7 ± ± 7.7 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 17 Changements conformationnels de CaM Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Ouverture des motifs EF-hands θ Linteraction avec EF requiert que C-CaM soit ouvert, chargé de calcium, et bloque N-CaM en conformation fermée. θ C-CaM S3 (°)S4 (°) 1k93-0Ca79.8 ± ± 4.3 1k93-2Ca74.4 ± ± 3.8 1k93-4Ca80.4 ± ± 4.6

18 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 18 1K93 1XFX Drum et al Shen et al (EF) Hel S1 S2 Structures cristallographiques (CaM) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre (EF) Hel (CaM) S1 S2

19 19 Changements conformationnels de CaM Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Ouverture des motifs EF-hands Mise en évidence dune influence du réseau dinteractions entre EF et N-CaM sur louverture des sites de fixation au calcium. θ θ N-CaM S1 (°)S2 (°) 1k93-0Ca33.4 ± ± 6.5 1k93-2Ca41.2 ± ± 7.3 1k93-4Ca43.7 ± ± 7.7 1xfx-4Ca36.7 ± ± 4.5 C-CaM S3 (°)S4 (°) 1k93-0Ca79.8 ± ± 4.3 1k93-2Ca74.4 ± ± 3.8 1k93-4Ca80.4 ± ± 4.6 1xfx-4Ca79.3 ± ± 2.8

20 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Glu 12 Asn 5 Asp 3 Asn 5 20 Distances au calcium dans les sites EF contraint directement S1 dans les deux systèmes 1k93 et 1xfx. Le réseau plus dense dinteractions entre EF et N-CaM dans 1xfx contraint indirectement S2. S1 S2

21 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion P : pas de dissociation C : dissociation commençante D : dissociation Leandro Martinez 21 «Locally enhanced sampling» : augmenter la probabilité de dissociation du calcium en utilisant plusieurs copies de lion. Simulations LES - CHARMM version 33b2 (200ps) - potentiel ligand-protéine réduit - fonction sigmoïdale diélectrique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Copies S1 P C 4D 7D 17D 29D 32D S2 P C 1D 4D 8D 19D S1 P C 6D 16D 9D 22D 32D S2 P C 10D 6D 29D 32D 1k93 1xfx

22 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Calculs dénergie libre Cycle thermodynamique de disparition du calcium 1xfx 1k93 G diss (Ca 2+ /1xfx) G diss (Ca 2+ /1k93) Intégration thermodynamique (application dune contrainte harmonique sur lion Ca 2+ ) 1k93G (kcal/mol) S ± 0.54 S ±

23 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 23 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Conclusion Stabilité de la forme EF-(2Ca-CaM) en accord avec les données expérimentales Modèle de linteraction EF-CaM exemple dune conformation inhabituelle de CaM Influence mutuelle EF-CaM / Ca 2+ -CaM modulation par EF de laffinité de CaM pour le calcium Données quantitatives de laffinité de CaM pour le calcium calculs dénergie libre (FEP, TI)

24 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 24 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Plan I. Stabilité de linteraction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs de EF a. Chemin dactivation de EF b. Définition dune poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques

25 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Architecture du complexe Hel N-CaM C-CaM SC SB SA CA CB

26 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 26 Bahar et al. (1997), Fold. Des. Modèle de réseau élastique Réseau élastique Simulations DM (Pearson) La méthode ENM prédit correctement les fluctuations thermiques (0.90 < R² < 0.99), mais ne permet pas de distinguer les différents niveaux de calcium. Les Cα distants de moins de 9 Ǻ sont connectés par des ressorts. Lindahl et al. (2006), Nucl. Acids Res.

27 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Corrélations dynamiques - méthode Lange & Grubmüller (2006), Proteins 27 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Coefficient de corrélation généralisée Information mutuelle Entropie de Shannon Corrélations généralisées Corrélations de Pearson - mesure moins biaisée - rend compte des corrélations non linéaires Classification hiérarchique

28 fortement corrélés (> 0.7) Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 28 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Corrélations dynamiques Fluctuations atomiques et groupes de résidus 100 non corrélés (< 0.5) moyennement corrélés ( ) 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca

29 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 29 CB CA SA SC Hel C N Définition de pseudo-domaines Les corrélations LFA permettent de redéfinir des pseudo-domaines. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Corrélations résiduelles de la méthode LFA

30 Srinivasan et al. (1998), J. Am. Chem. Soc. Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 30 Influences énergétiques - méthode Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Méthode MMPBSA Mécanique moléculaire E int + E vdw + E ele Interactions polaires de solvatation Poisson - Boltzmann Interactions non polaires de solvatation Surface Accessible Entropie conformationnelle Modes Normaux

31 Hamacher et al. (2006), PloS Comput. Biol. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Si Rang -Y (X') moins bon que Rang ref (X'), alors Y influence la stabilité de X' au sein du complexe. (intensité = nb de rangs perdus) 31 Influences énergétiques - méthode Rang de réference Rang ref Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X au reste du complexe. Rang relatif Rang -Y Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X au complexe amputé du domaine Y. Cartes de dépendances énergétiques CA CB SA SC Hel NCaM CCaM Rang ref Rang -Hel

32 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Influences énergétiques 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Hiérarchie relative de stabilité des domaines au sein du complexe 1k93-2Ca : centrées, équilibrées 1k93-0Ca : perte dinfluences 1k93-4Ca : plus diffuses * * * * * * * * 32

33 33 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion La stabilité du complexe dépend de la connexité du réseau de résidus. Connexité du réseau de résidus 1k93-2Ca1k93-0Ca1k93-4Ca Influences énergétiques & corrélations dynamiques * * * * * * * *

34 34 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Conclusion Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion Architecture globale du complexe modèle de réseau élastique Dynamique globale et locale groupes de résidus et domaines dynamiques Connexité du réseau de résidus propagation de linformation Tests des modèles par lexpérience protéolyse, fluorescence, mutations

35 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 35 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Plan I. Stabilité de linteraction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche dinhibiteurs de EF a. Chemin dactivation de EF b. Définition dune poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques

36 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Transition conformationnelle de EF Translation de 15 Å Rotation de 30° Boucle SB désordonnée Drum et al (1K8T et 1K93)

37 Détermination de chemin de réaction 37 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Chemin : série de conformations qui ne sont séparées par aucune barrière énergétique. Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Chemin dactivation de EF - méthode Fischer & Karplus (1992), Chem. Phys. Lett. Arnaud Blondel Cycle daffinement : (i) réduction du nombre de conformations (ii) échantillonnage entre des paires de conformations, avec lalgorithme «Conjugate Peak Refinement» (CPR). Premier jet : Simulations DM orientées

38 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 38 Chemin de transition

39 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 39 Analyse des mouvements de EF Le chemin de transition de EF permet dexplorer des régions de lespace conformationnel non atteignables par les simulations du complexe EF-CaM. Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de EF le long du chemin

40 40 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Lee et al. (2004) Chem Biol. Site catalytique 933 Å Å Å 3 SABC 450 Ǻ Å 3 Identification de la poche ICM PocketFinder – Trotov & Abagyan (2004), Genome Inform. Recherche systématique de poches

41 41 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Switch C Switch B Switch A Identification de la poche Stratégie : Sélectionner des molécules capables de se fixer sur la poche SABC dans la forme inactive de EF et de maintenir sa forme, bloquant ainsi lactivation.

42 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 42 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Abagyan et al. (1994), J. Comput. Chem. Placement du fragment de base Outils de criblage virtuel FlexX ICM Rarey et al. (1996), J. Mol. Biol. Configuration initiale Rotation/Translation aléatoire E 1 < E 0 E0E0 E 2 > E 0 Rotation/Translation aléatoire Application du critère de Metropolis Reconstruction incrémentale

43 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Approche in silico / in vitro 43 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Criblage VirtuelValidation expérimentale Chimiothèque Nationale mol. 1. Elagage S < m mol. meilleur 1% Conformations intermédiaires comme contrôles négatifs. Sélection des meilleurs ligands. Tests enzymatiques 18 composés testés 30% inhibent totalement lactivité de EF à des concentrations de µM.

44 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 44 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 CyaA Inhibiteurs de lactivité de EF (Ki ~ 2-3 µM) activité enzymatique (1) activité enzymatique (2) Tests enzymatiques Christophe Goncalves, Johanna Karst Daniel Ladant EF CaM + I ATP EF CaM + I ATP F CH 3 -O diCl H Br Cl (1) (2)

45 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Inhibition de CyaA Boucle SC / queue C-term Boucle SB / Boucle T300-K312 Boucle SA / Hélices F-G-H-H Comparaison des structures de EF et CyaA Guo et al SABC de EF : 16 résidus 6 identiques, 5 similaires chez CyaA

46 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs a. Chemin dactivation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Inhibition de EF-CaM Analyse des poches à la surface de EF le long des trajectoires DM du complexe EF-CaM Poche résiduelle Å 3 Site catalytique

47 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 47 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Conclusion Modélisation dune transition complexe conformations intermédiaires plausibles Définition dun site de liaison potentiel stratégie innovante : cibler une poche allostérique Identification dinhibiteurs nouvelle famille de composés, affinités de quelques µM Caractérisation du mode de liaison des composés résolution dune structure co-cristallisée

48 Introduction I. Stabilité de linteraction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche dinhibiteurs Conclusion 48 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Conclusion générale et perspectives Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM modèle de linteraction EF-CaM influence mutuelle entre les interactions EF-CaM et Ca 2+ -CaM modèle de leffet du calcium sur le réseau de résidus Mobilité structurale de la protéine EF chemin plausible de transition conformationnelle modulation de lactivité enzymatique par effet allostérique identification dune nouvelle famille dinhibiteurs Extrapolation à la toxine CyaA de B. pertussis caractéristiques différentes de EF mécanismes de lactivation par CaM déterminants de laffinité des inhibiteurs

49 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Remerciements Benjamin Bardiaux Giacomo Bastianelli Aymeric Bernard Renée Communal Pak-Lee Chau Claire Colas Nathalie Duclert Julia Forman David Giganti Christophe Goncalves Tru Huynh Leandro Martínez (Brésil) Olivier Perin Edithe Selwa Edouard Yeramian Arnaud Blondel Thérèse Malliavin Michael Nilges Unité Biochimie des Interactions Macromoléculaires Alexandre Chenal Johanna Karst Daniel Ladant University of Chicago Wei-Jen Tang CERMN Aurélien Lesnard Sylvain Rault Claire Dane Gilles Vergnaud B I S Universidade Federal Fluminense Julliane Yoneda

50 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Equilibration 1k93-4Ca Distances de coordination du calcium dans S1 et S2 * : contraintes de distance de 10 kcal/mol/Å 2

51 51 Plasticité de EF Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Modes (1 et 2) PCA de EF

52 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Changements conformationnels de CaM Exposition des patches hydrophobes C C C C N N N N C C N N

53 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Réseau dinteractions EF-(N-CaM)

54 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Matrice de KirchhoffFluctuations prédites Réseau élastique et corrélation Similarités entre matrices de corrélations

55 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Classification hiérarchique

56 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Corrélations généralisées - classification Classification hiérarchique des résidus en fonction de leurs corrélations généralisées

57 57 Zhang & Wriggers (2006), Proteins Dynamique locale - méthode Analyse locale des traits caractéristiques (LFA) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 Analyse en composantes principales (ACP) Information par mode (globale) Réduction de dimensionalité (15 modes = % fluct.) Information par degré de liberté (locale) Réduction de dimensionalité ? algorithme de clairsemage Le formalisme LFA permet didentifier des résidus « graines », autour desquels sarticulent des domaines dynamiques locaux.

58 58 Dynamique locale Polarisation du site catalytique autour de deux spots. Propagation du signal calcium le long de CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

59 59 Test de Kolmogorov-Smirnov Test non paramétrique : pas dhypothèse sur la nature des données Tester si deux échantillons sont issus de la même distribution H0 : les deux échantillons proviennent dune même distribution H1 : les deux échantillons proviennent de distribution différentes P-value = probabilité dobserver les échantillons sous lhypothèse nulle. Principe : comparaison des fonctions de répartition empiriques F(x) = P(X

60 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Contributions MMPBSA Energies libres de liaison de référence 1k93-2Ca

61 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Contributions MMPBSA Différences dénergies libres de liaison

62 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Caractéristiques du chemin Historique de laffinementChemin final

63 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Similarités de formes – ROCS

64 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre Structural interaction fingerprints

65 65 Robustesse de la poche Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009


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