Matériaux pour la microscopie optique non linéaire intra vitale

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1 Matériaux pour la microscopie optique non linéaire intra vitale
Conseil Scientifique du CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Jeudi 14 avril 2005 Un projet à l’interface Biologie/Physique/Chimie Une problématique biologique. J. Coles « Neuroimagerie Fonctionnelle et Métabolique » INSERM M. Albrieux, « Laboratoire de Canaux Ioniques et Signalisation » CEA-INSERM Des mesures physiques. J.-C. Vial, P. Baldeck « Spectrométrie Physique » UJF Des sondes chimiques. A. Ibanez « Matériau pour l’optique » CNRS C. Andraud « Chimie pour l’optique » ENS-Lyon

2 Deux projets de chimistes
Ingénierie moléculaire de chromophores pour l'imagerie du potentiel membranaire de neurones par microscopie optique non-linéaire » C. Andraud, C. Barsu, Y. Bretonnière, O. Maury « Elaboration de nanocristaux moléculaires fluorescents pour l'imagerie du cortex cérébral de souris par luminescence excitée à 2 photons » N. Sanz, A. Ibanez Mertz, Current Opinion in Neurobiology

3 2w w Les microscopies non linéaires TPEF SHG
Terme générique qui englobe toute les techniques basées sur l’optique non linéaire Fluorescence induite par absorption à deux photons TPEF Génération de seconde harmonique SHG TPEF w 2w ground excited ONL du 3e ordre Processus résonnant incohérent Signal de phase aléatoire Prop n w 2w SHG ONL du 2e ordre sensible à l’ordre local Non centrosymétrie Processus non résonnant cohérent Signal de phase contrôlée Prop n2

4 Les microscopies non linéaires pour l’imagerie cellulaire
Des techniques complémentaires TPEF Excitation 1) confocale (résolution 3D, limite les photo-dommages sur le trajet optique) 2) a lieu dans l’IR (profondeur de pénétration accrue, domaine de transparence des milieux biologiques) SHG Non-centrosymétrie locale par orientation dans une membrane Centrosymétrie locale à la jonction des deux GUV Mertz & Blanchard-Desce, Biophys.J.2001, 1568.

5 La SHIM pour la mesure du potentiel membranaire Vm
Potentiel membranaire (diffusion Ca+) 0-100 mV Image SHG de neurones de rat Vm imposé par patch-clamp Démonstration de principe concluante mais 1) Addition de co-solvant (DMSO, EtOH) 20 min de durée de vie cellulaire 2) Photo-dommage (ADP) 3) Désorientation dans la membrane (flip-flop) Yuste & al, J. Biomed.Optics, 2004, 9, 873

6 Le cahier des charges de la sonde
Contrainte de fonctions Non centrosymétrique (SHG) Fluorescente Répondre au Vm (électrochromisme, réorientation) Ordre de Grandeur Imager le Vm (SHG esu varie de 20%) Résolution spatiale (0,6 mm) Résolution temporelle (1 ms) Solubilité (100 nMol) lmax (laser) = 800 nm donc lmax(sonde) vers 400nm Contraintes de forme Amphiphile Soluble dans l’eau S’orienter dans la membrane sans traverser Stable photochimiquement Non toxique

7 Les sondes actuelles Elles ont toutes permis la mise en évidence du phénomène mais aucune ne remplit complètement le cahier des charge Contraintes de fonction respectées mais pas les contraintes de forme Faible diversité « Better dyes and optimized microscope optics could ultimately lead to the imaging of neuronal activity with SHIM » Leslie Loew, Nature Biotech. 2003, 21, 1356

8 Projet 1 : Hydrosolubilité
Rouge:contrainte de fonction (chromophore dipolaire, donneur et accepteur fort, neutre, Dm important, stabilité) Bleu: Contrainte de fonction (Glucose pour assurer la solubilité dans l’eau, x profondeur d’ancrage dans la membrane, n caractère amphiphile, m et X balance hydrophile/hydrophobe)

9 Projet 1 : Synthèse d’une molécule modèle (C. Barsu)
9 étapes de synthèse Echelle gramme

10 Projet 1 : Caractérisation d’une molécule modèle
Fort transfert de charge lmax = 411 nm, e = soit f = 0,71 Simulation théorique TD-DFT R. Fortrie lmax = 438 nm; f = 1 Dm = Activité ONL significative Forte réponse électrochromisme

11 Projet 1 : Introduction des contraintes de forme
1, 2 groupements hydrosolubles 5 étapes Espaceur C2  C4 Balance C6 ? Chaînes hydrophobes C2  C8 Forte modularité de la structure

12 Projet 2 : Chromophore à forte réponse orientationnelle
Chromophore qui se réoriente dans la membrane en présence du champ et qui se désoriente en l’absence de champ : BIS-DIPOLE Encombrement stérique et la répulsion électrostatique implique la désorientation des deux dipôles, f important Orientation parallèle des deux dipôles dans le sens du champ, f faible additivité des activités ONL

13 Projet 2 : Molécule cible et simulation
Bis-dipôle, Donneur rouge Accepteur bleu Simulation théorique DFT R. Fortrie F = 115°

14 Conclusion Approche du chimiste sur une problématique biologie/physique/chimie « mesure du potentiel de membrane de neurone » Développer une véritable ingénierie moléculaire dévolue à la conception de sondes en tenant compte des contraintes de fonction et de forme. Hydrosolubilité (projet 1) Réorientation sous champs (projet 2) Assurer le développement des ces sondes en étroites interactions avec nos collègues biologistes et physiciens. Projet à Quatre ans sur lequel travaillent 1 doctorant et 1stagiaire puis 1 étudiante en Master recherche (Sept 05)