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Matériaux pour la microscopie optique non linéaire intra vitale Conseil Scientifique du CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Jeudi.

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1 Matériaux pour la microscopie optique non linéaire intra vitale Conseil Scientifique du CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Jeudi 14 avril 2005 Un projet à linterface Biologie/Physique/Chimie Une problématique biologique. J. Coles « Neuroimagerie Fonctionnelle et Métabolique » INSERM M. Albrieux, « Laboratoire de Canaux Ioniques et Signalisation » CEA- INSERM Des mesures physiques. J.-C. Vial, P. Baldeck « Spectrométrie Physique » UJF Des sondes chimiques. A. Ibanez « Matériau pour loptique » CNRS C. Andraud « Chimie pour loptique » ENS-Lyon

2 Deux projets de chimistes « Elaboration de nanocristaux moléculaires fluorescents pour l'imagerie du cortex cérébral de souris par luminescence excitée à 2 photons » N. Sanz, A. Ibanez Ingénierie moléculaire de chromophores pour l'imagerie du potentiel membranaire de neurones par microscopie optique non- linéaire » C. Andraud, C. Barsu, Y. Bretonnière, O. Maury Mertz, Current Opinion in Neurobiology

3 Les microscopies non linéaires Terme générique qui englobe toute les techniques basées sur loptique non linéaire Fluorescence induite par absorption à deux photons TPEF Génération de seconde harmonique SHG ground excited TPEF ONL du 3e ordre Processus résonnant incohérent Signal de phase aléatoire Prop n SHG ONL du 2e ordre sensible à lordre local Non centrosymétrie Processus non résonnant cohérent Signal de phase contrôlée Prop n 2

4 Les microscopies non linéaires pour limagerie cellulaire Des techniques complémentaires TPEF SHG Excitation 1) confocale (résolution 3D, limite les photo-dommages sur le trajet optique) 2) a lieu dans lIR (profondeur de pénétration accrue, domaine de transparence des milieux biologiques) Non-centrosymétrie locale par orientation dans une membrane Mertz & Blanchard-Desce, Biophys.J.2001, Centrosymétrie locale à la jonction des deux GUV

5 Yuste & al, J. Biomed.Optics, 2004, 9, 873 La SHIM pour la mesure du potentiel membranaire Vm Image SHG de neurones de rat Vm imposé par patch-clamp Potentiel membranaire (diffusion Ca + ) mV Démonstration de principe concluante mais 1) Addition de co-solvant (DMSO, EtOH) 20 min de durée de vie cellulaire 2) Photo-dommage (ADP) 3) Désorientation dans la membrane (flip-flop)

6 Contrainte de fonctions Non centrosymétrique (SHG) Fluorescente Répondre au Vm (électrochromisme, réorientation) Le cahier des charges de la sonde Contraintes de forme Amphiphile Soluble dans leau Sorienter dans la membrane sans traverser Stable photochimiquement Non toxique Ordre de Grandeur Imager le Vm (SHG esu varie de 20%) Résolution spatiale (0,6 m) Résolution temporelle (1 ms) Solubilité (100 nMol) max (laser) = 800 nm donc max (sonde) vers 400nm

7 Les sondes actuelles Elles ont toutes permis la mise en évidence du phénomène mais aucune ne remplit complètement le cahier des charge Contraintes de fonction respectées mais pas les contraintes de forme Faible diversité « Better dyes and optimized microscope optics could ultimately lead to the imaging of neuronal activity with SHIM » Leslie Loew, Nature Biotech. 2003, 21, 1356

8 Projet 1 : Hydrosolubilité Rouge:contrainte de fonction (chromophore dipolaire, donneur et accepteur fort, neutre, important, stabilité) Bleu: Contrainte de fonction (Glucose pour assurer la solubilité dans leau, x profondeur dancrage dans la membrane, n caractère amphiphile, m et X balance hydrophile/hydrophobe)

9 Projet 1 : Synthèse dune molécule modèle (C. Barsu) 9 étapes de synthèse Echelle gramme

10 Projet 1 : Caractérisation dune molécule modèle Simulation théorique TD-DFT R. Fortrie max = 438 nm; f = 1 = Fort transfert de charge max = 411 nm, = soit f = 0,71 Activité ONL significative Forte réponse électrochromisme

11 Projet 1 : Introduction des contraintes de forme Chaînes hydrophobes C2 C8 1, 2 groupements hydrosolubles 5 étapes Espaceur C2 C4 Balance C6 ? Forte modularité de la structure

12 Projet 2 : Chromophore à forte réponse orientationnelle Chromophore qui se réoriente dans la membrane en présence du champ et qui se désoriente en labsence de champ : BIS-DIPOLE Encombrement stérique et la répulsion électrostatique implique la désorientation des deux dipôles, important Orientation parallèle des deux dipôles dans le sens du champ, faible additivité des activités ONL

13 Projet 2 : Molécule cible et simulation Simulation théorique DFT R. Fortrie = 115° Bis-dipôle, Donneur rouge Accepteur bleu

14 Conclusion Approche du chimiste sur une problématique biologie/physique/chimie « mesure du potentiel de membrane de neurone » Développer une véritable ingénierie moléculaire dévolue à la conception de sondes en tenant compte des contraintes de fonction et de forme. Hydrosolubilité (projet 1) Réorientation sous champs (projet 2) Assurer le développement des ces sondes en étroites interactions avec nos collègues biologistes et physiciens. Projet à Quatre ans sur lequel travaillent 1 doctorant et 1stagiaire puis 1 étudiante en Master recherche (Sept 05)


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