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Confirmation microbiologie des cas dUlcère de Buruli Cours International Centre Pasteur du Cameroun Yaounde, 23-30 janvier 2006 F. Portaels.

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1 Confirmation microbiologie des cas dUlcère de Buruli Cours International Centre Pasteur du Cameroun Yaounde, janvier 2006 F. Portaels

2 Confirmation microbiologique des cas dUlcère de Buruli I. Pourquoi ? 1. En zone dendémie: augmenter la qualité du diagnostic clinique confirmer la qualité des excisions chirurgicales confirmer des cas déchecs, de rechutes confirmer lefficacité déventuels traitements antimycobactériens analyser les souches de M. ulcerans 2. En zone non endémique confirmer la présence de lUB

3 II. Comment ? Examen direct Culture PCR Histopathologie Un vrai cas dUB est confirmé par au moins 2 résultats positifs (OMS, 2001) N.B. Pour les centres qui ont une excellente expérience dans le diagnostic clinique de lUB un seul résultat positif pourrait suffir.

4 III. Recueil des échantillons 1. Formes non ulcérées Echantillons prélevés à partir des tissus excisés chirurgicalement. Prélever au centre du tissu excisé (ex: graisse nécrosée) Placer les fragments de tissus (2 4 mm 3 ) dans le milieu de transport (MT) Enfoncer au fond du MT (Le MT doit complètement entourer le fragment)

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6 2. Formes ulcérées 2.1. Ecouvillons Ecouvillonnages multiples sous les bords décollés de lulcère (la répartition des bactéries peut être très hétérogène) Ne pas écouvillonner le centre de lulcère 2.2. Tissus prélevés à partir dune excision chirurgicale cf. formes non ulcérées

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11 3. Formes osseuses 3.1. Diagnostic microbiologique Uniquement dans des centres de référence. Produits de curetages, fragments dos, gelée à placer dans le milieu de transport (cf. les autres formes).

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13 3.2. Facteurs de risque datteinte osseuse I. Facteurs microbiologiques 1. Charge bacillaire des lésions cutanées à lexamen anatomo-pathologique: –patients avec atteintes osseuses: 95.8% Z+ –patients sans atteintes osseuses: 52.4% Z+ 2. Rôle des germes de surinfection (staphylo, strepto)? NEANT !

14 3. La virulence des souches pourrait jouer un rôle important. –Souches africaines: les plus virulentes atteintes osseuses –Souches australiennes, américaines: moins virulentes pas datteintes osseuses 4. Survie à 37°C des mycobactéries isolées des os? NON ! –Les souches des os survivent moins bien in vitro à 37°C que celles de la peau! –Les souches des os poussent moins bien in vitro à 33°C que celles de la peau!

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17 Analyses microbiologiques Culture positive Examen directlésion cutanéelésion ossseuse 4+16/17 (94.1%) 5/12 (41.7%) 3+ 7/13 7/ /12 4/11 1 2/8 1/12 - 3/11 6/22 Total33/61 (54.1%)23/70 (32.9%)

18 Facteurs de risque datteinte osseuse II. Facteurs liés à lhôte 1. Le délai à la consultation joue un rôle primordial! –médiane pour patients sans atteinte osseuse: 46 jours –médiane pour patients avec atteinte osseuse: 91 jours 2. Présence dune ancienne cicatrice –guérison naturelle –guérison après traitement traditionnel 3. Infection par le VIH 4. Autres maladies (schistosomiase, drépanocytose, … ) 5. Autres facteurs (génétiques? immunitaires?

19 IV. Positivité des tests en fonction des formes cliniques (cas définis par au moins 2 tests positifs) Résultats de Zagnanado (Benin) FormesNombre de cas positifs (%+) cliniques ZN Culture PCR Histopathologie Nodule 20 (62.5) 16 (59.3) 29 (93.5) 18 (94.7) Oedème 4 (80.0) 4 (80.0) 6 (100.0) 3 (100.0) Plaque268 (82.7)201 (83.4)314 (98.8) 79 (98.8) Ulcère 125 (72.3) 91 (65.9)167 (98.7) 83 (94.3) Os 24 (63.2) 7 (20.6)38 (100.0) 24 (85.7) Forme mixte274 (85.1)201 (75.0)306 (98.7) 98 (96.1) Ulcère en voie de guérison 20 (74.1) 15 (78.9)26 (100.0) 3 (100.0) Autres - 1 (50.0) 2 (100.0) - TOTAL735 (79.6)536 (73.0)888 (98.7)308 (95.1) Formes ulcérées vs formes non p=< NS NS ulcérées

20 V. Nombre déchantillons à prélever par patient Résultats de Zagnanado (Benin) NombreNombre de cas% cas déchantillonsconfirmés par auconfirmés moins 2 tests+/total 1375 / % 2277/ % 387/ % >4156 / %

21 VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. Patient n°Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose

22 VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite) Patient n°Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose

23 VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite) Patient n°Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose TOTAL %

24 Distribution hétérogène des bacilles: résumé Nombre de biopsies punch positives pour 2 tests chez 6 patients Patient n°Nb+/total%+ 12/540 26/786 38/989 43/560 55/ /650

25 VII. Quelques questions Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ?

26 Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ? R1. -Oui, pour éviter un diagnostic erroné (faux positif, faux négatif) -Néanmoins: risque de ne pas pouvoir confirmer une forme paucibacillaire (ex: ulcère avec granulome)

27 Q2. La sensibilité des tests varie-telle en fonction des formes cliniques ?

28 Q2. La sensibilité des tests varie-telle en fonction des formes cliniques ? R2Oui -ZN et culture plus fréquemment positifs pour les formes non ulcérées -PCR et histopathologie: pas de différence

29 Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ?

30 Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ? R3 * la PCR IS2404 en premier choix car: -sensibilité de 93.5% à 100% suivant les formes cliniques -peut être appliqué à des écouvillonnages -peut être appliqué sur des échantillons conservés dans lalcool -test compliqué, coûteux -nécessité dun laboratoire bien équipé -risques de faux positifs (matériel à usage unique indispensable) *lhistopathologie car -sensibilité de 84.3% à 100% -importante pour les formes paucibacillaires -peut fournir un diagnostic différentiel

31 Q4. Combien faut-il prélever déchantillons pour confirmer un diagnostic dUB ?

32 Q4. Combien faut-il prélever déchantillons pour confirmer un diagnostic dUB ? R4. Au moins 2 échantillons car: -distribution hétérogène des bacilles -augmente la positivité des patients

33 VIII. Conservation et transport des échantillons 1. Analyse immédiate: récipient stérile sans additif 2. Echantillons à transporter 2.1. Analyse dans les 24 heures garder à +4°C ou au froid dans un frigo-box (avec glace) 2.2. Au-delà de 24 heures (cas le plus fréquent) utiliser un milieu de transport (MT) garder les MT à +4°C jusquau moment de lenvoi

34 IX. Milieu de transport semi-solide (SEMI) 1. Composition Middlebrook 7H9 + PANTA (Becton-Dickinson) (Polymixine B, Amphotéricine B, acide Nalidixique, Triméthoprime, Azlocilline) + 0.5% agar 2. Avantages Transport à t° ambiante Contrôle des contaminations (PANTA) Survie de M. ulcerans pendant longtemps (> 1 mois) Remarque: ce nest PAS une raison pour laisser traîner les échantillons ! Survie des autres mycobactéries (M. tuberculosis, M. chelonae)

35 3. Nos résultats après transport dans le SEMI Cultures positives à partir déchantillons des pays suivants: Bénin Côte dIvoire République Démocratique du Congo Angola Papouasie-Nouvelle Guinée Australie PCR, séquençages positifs pour M. ulcerans à partir des échantillons (négatifs en culture) des pays suivants Soudan Ouganda Pérou

36 X. Diagnostic microbiologique de lUB Comparaison des résultats de 2 laboratoires: 1. Le Laboratoire de Référence des Mycobactéries (LRM) de Cotonou (Prof. S. Anagonou et Dr. D. Affolabi) 2. LInstitut de Médecine Tropicale (IMT) dAnvers (Prof. F. Portaels)

37 1. Matériel et méthodes Patients cliniquement suspects dUB Fragments de tissus prélevés lors des excisions Chaque fragment est coupé en 2 - un morceau pour le LRM - un morceau pour lIMT Chaque morceau est placé dans le milieu de transport Conservation à +4°C jusquau moment de lenvoi

38 2. Résultats 2.1. Examen direct LRM: Auramine + : 234/359 = 65.2% IMT: Ziehl + : 179/359 = 49.9% IMT LRM Coefficient kappa: 0.46

39 2.2. Culture Cultures positives sur LJ / total non contaminé LRM: 90/233 = 38.6% IMT: 101/233 = 43.3% IMT LRM Coefficient kappa: 0.46

40 Contaminations LRM: 77/404 = 19.1% IMT: 63/404 = 15.6%

41 3. Comparaison LRM-IMT: conclusions La coloration à lAuramine donne de meilleurs résultats que le Ziehl (65% vs 50%) La positivité des cultures est comparable (39% vs 43%) La concordance est moyenne hétérogénéité des tissus ! Taux de contaminations légèrement plus élevés au LRM quà lIMT (19% vs 16%) MAIS:LRM: hotte aspirante au moment de létude! Maintenant: flux laminaire !

42 Le transfert de technologie est réussi: Le LRM est un excellent laboratoire pour la confirmation microbiologique des cas dUB par examen direct et par culture

43 XI. Analyse des échantillons négatifs par examen direct, culture et PCR UB confirmé sur des échantillons antérieurs UB non actif ou guéri Infections secondaires Autres:12 / 404=3% plaques:5 nodules:3 ulcères:3 tuméfaction:1

44 Mycobacterium ulcerans Disease (Buruli Ulcer) in Rural Hospital, Southern Benin, Debacker et al. Emerg Infect Dis 2004; 10: XII. L ulcère de Buruli dans un centre de santé rural au Bénin

45 CSNG Zagnanado Le Centre Sanitaire et Nutritionnel Gbemoten (CSNG) Premier cas traité en 1977 aujourdhui: plus de 4000 patients

46 Létude 1700 patients UB admis entre autres affections:13 patients rechutes: 57 patients (3.3%) 1630 patients UB pour lanalyse

47 1630 patients 13 patients: confirmation dune maladie autre que lUB abcès à M. chelonae:4 tuberculose cutanée:5 diphtérie cutanée:1 mucormycose:2 ostéosarcome:1

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49 % positivité des examens de laboratoire en fonction des formes cliniques FormeZiehl+ Cult+PCR+Histo+ ulcère nodule oedème plaque os formes mixtes

50 XIII. Pourquoi les échantillons sont-ils négatifs ? 1. Cest un vrai cas dUB ! le choix du fragment nest pas bon: - trop superficiel (ex: Guinée) - tissus prélevés en dehors des lésions nécrosées tissus trop contaminés - lors du prélèvement - pendant le transport (tissus non enfoncés au fond du milieu de transport) lésions en voie de guérison, en voie de cicactrisation erreurs de n°s, erreurs au laboratoire

51 2. LUB est présent dans la région mais ce nest pas un cas dUB ! Autres affections cf diagnostic différentiel (guide à lusage des professionnels de la Santé) 3. LUB nest pas présent dans la région

52 XIV. Quelques derniers conseils 1.Demander au chirurgien de prélever lui-même les tissus nécrosés. Les placer dans un récipient stérile (plateau ou boîte de Pétri) 2.Prélever plusieurs échantillons (au moins 2) par patient (répartition hétérogène des BAAR dans les lésions) 3. Marquer les n°s sur les boîtes de Petri et milieux de transport au crayon ou stylo à bille sur un sparadrap (les marqueurs seffacent à lhumidité !). 4.Prévoir un flacon avec formol pour lhistopathologie (très important pour le diagnostic différentiel)

53 XIV. Quelques derniers conseils (suite) 5.En routine, faire dabord un examen direct (ED) 6.Si ED négatif PCR recommandé 7.Culture: peu sensible surtout pour les lésions osseuses. Importante pour lévaluation des traitements antimycobactériens, pour la recherche (empreintes génétiques).


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