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TP3: MUTAGENESE DUNE SOUCHE DE LEVURE SOUS LEFFET DE LENVIRONNEMENT.

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2 TP3: MUTAGENESE DUNE SOUCHE DE LEVURE SOUS LEFFET DE LENVIRONNEMENT

3 Situation déclenchante Situation déclenchante Une souche de Levure (Champignon unicellulaire), appelée Ade2, présente une chaîne de synthèse de ladénine incomplète aboutissant à laccumulation dun composé A.I.R. (Amino Imidazole Ribotide) se pigmentant en rouge par oxydation : la souche est, de ce fait, de couleur rouge (pour cultiver cette souche, il est donc nécessaire dutiliser un milieu de culture contenant de ladénine) Toute mutation affectant les gènes impliqués dans cette chaîne de synthèse de lA.I.R. empêche la formation de ce composé et provoque la disparition du pigment rouge : les levures sont alors blanches. Dautres mutations concernant des gènes importants du métabolisme de la Levure peuvent entraîner la mort de la cellule. Il sagit de mutations dites létales.

4 Problématique : lintensité dun agent mutagène, ici les UV, a-t-elle une influence sur le type de gènes qui seront mutés ? Problématique

5 -Formulation de deux hypothèses et de leur conséquences vérifiables -Construction dun tableau de dénombrement des différentes colonies de Levure pour chaque durée dexposition -Réalisation dun tableau de % de létalité et de % de colonies blanches -Construction dun graphique à laide du tableur « Excel » présentant lévolution des deux pourcentages en fonction de la durée dexposition aux UV. -Réponse aux questions posées permettant de résoudre la problématique.. Consigne

6 Rappel: Démarche expérimentale Rappel: Démarche expérimentale Protocole de manipulation en microbiologie Protocole de manipulation en microbiologie Aide à la manipulation Aide à la manipulation Aide à la résolution Aide à la résolution

7 NOM DES ETAPES SIGNIFICATION DES ETAPES OBSERVATION = CONSTAT DUN PHÉNOMÈNE BIOLOGIQUE OU GÉOLOGIQUE Données d'origines diverses: médias, scolaires, personnelles.. PROBLEME Question issue de l'observation du phénomène biologique ou géologique observé HYPOTHESE Solution provisoire au problème posé. (=supposition) (on peut formuler plusieurs hypothèses pour résoudre un même problème) CONSEQUENCE VERIFIABLE Résultats auxquels on peut s'attendre si l'hypothèse est valide = Résultats prédictifs

8 EXPERIENCE (4 sous-étapes : Principe Dispositif expérimental Protocole Réalisation Elaboration et réalisation dun protocole expérimental pour éprouver lhypothèse. Le protocole expérimental doit respecter les 4 règles suivantes : * Le paramètre testé doit être supprimé et/ou doit varier * Il ne faut tester quun seul paramètre à la fois ( les autres devant être optimaux et constants ) * Il faut réaliser une expérience témoin * Il faut réaliser plusieurs fois lexpérience RESULTATS Constat des différences entre le début et la fin de lexpérience = Analyse des résultats INTERPRETATION Confrontation des résultats avec les résultats prédictifs doù lhypothèse est validée ou réfutée ou Sans formulation dhypothèse, linterprétation correspond à lexplication des résultats proposés NOM DES ETAPES SIGNIFICATION DES ETAPES

9 ATTENTION ! Pour votre sécurité et la réussite de lexpérience, respecter bien les conditions de travail suivantes : Porter une blouse en coton Passer les mains à lalcool Aseptiser la paillasse Travailler uniquement dans une zone de stérilité lors de la manipulation des levures, des milieux et instruments stériles Ne pas toucher le milieu des boîtes de pétri avec les mains Eviter les mouvements brusques et de parler devant les boîtes ouvertes Placer les pipettes souillées dans un pot de javel Étalement des suspensions de levures sur la gélose des boîtes de pétri : Toujours agiter la suspension de levures avant den prélever, car les levures sédimentent rapidement Verser avec un compte-gouttes stérile, 0,1 ml (2 gouttes) de la suspension de levures ade2 sur chacune des boîtes de milieu de culture mises à votre disposition. Étaler immédiatement avec un étaleur stérile dun mouvement circulaire et répété, afin de répartir le mieux possible le liquide sur le milieu (attention à ne pas endommager la surface de la gélose). Fermer les boîtes puis tracer sur une des deux boîtes, 4 secteurs sur le fond de la boîte référencés : I, II, III et IV Penser à également indiquer un nom du binôme pour retrouver les boîtes facilement

10 Éteindre la lampe Introduire la boîte de pétri sectorisée gélose vers le haut dans lenceinte à UV C. Enlever le couvercle des boîtes (Il est conseillé de laisser les couvercles à lintérieur pour quils restent dans des conditions de stérilité). Remplacer par un couvercle découpé présent dans lenceinte en mettant louverture sur le secteur I Vérifier le positionnement de la bavette transparente et la fermeture de la porte battante avant chaque période dirradiation Démarrer le chronomètre une fois la lampe allumée Exposer pendant 15 secondes le secteur I Tourner le couvercle dun quart de tour Exposer pendant 45 secondes le secteur II Tourner le couvercle dun quart de tour Exposer pendant 90 secondes le secteur III Tourner le couvercle dun quart de tour Exposer pendant 120 secondes le secteur IV Dans lenceinte enlever le couvercle découpé, le remplacer par un couvercle entier puis sortir la boîte de Pétri de lenceinte.

11 AIDE à la manipulation -Lisez attentivement la fiche technique « Travail en conditions stériles » afin de mener à bien votre expérience. - Suivez rigoureusement les étapes de la fiche protocole : « Ensemencement et exposition aux UV ». AIDE à la manipulation -Lisez attentivement la fiche technique « Travail en conditions stériles » afin de mener à bien votre expérience. - Suivez rigoureusement les étapes de la fiche protocole : « Ensemencement et exposition aux UV ».

12 AIDE à la résolution -Pour le tableau de dénombrement, pensez aux différentes catégories de colonies quil vous faudra dénombrer. -Pour le calcul de %, pensez aux quantités totales pour chaque rapport. - Pour répondre à la question sur la variation des effets de lagent mutagène, comparez les deux courbes du graphique après avoir fait le lien entre les différents types de mutations pouvant affecter la souche Ade2 et les % calculés. AIDE à la résolution -Pour le tableau de dénombrement, pensez aux différentes catégories de colonies quil vous faudra dénombrer. -Pour le calcul de %, pensez aux quantités totales pour chaque rapport. - Pour répondre à la question sur la variation des effets de lagent mutagène, comparez les deux courbes du graphique après avoir fait le lien entre les différents types de mutations pouvant affecter la souche Ade2 et les % calculés.


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