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1 Service de Bactériologie Département des Maladies infectieuses et parasitaires Faculté de Médecine Vétérinaire Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques.

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1 1 Service de Bactériologie Département des Maladies infectieuses et parasitaires Faculté de Médecine Vétérinaire Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques dEscherichia coli en médecine vétérinaire Cours de bactériologie 2ème doctorat Cours de bactériologie 2ème doctorat

2 2 AcronymsPathotypes (or virulotypes) EHECEnterohaemorrhagic E. coli EPECEnteropathogenic E. coli DHECDiarrhea-associated Haemolytic E. coli ExPECExtraintestinal E. coli UPECUropathogenic E. coli NMECNeonatal Meningitis E. coli APECAvian Pathogenic E. coli ETECEnterotoxigenic E. coli VTECVerocytotoxigenic E. coli CDECCell Detaching E. coli CDTECCytolethal Distending E. coli NTECNecrotoxigenic E. coli AEECAttaching-Effacing E. coli EIECEntero-invasive E. coli EAECEnteroaggregative E. coli DAECDiffusely-adherent E. coli Pathogenic strains of Escherichia coli

3 3 Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains producing attaching/effacing lesions (AE) Verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) strains producing only Shiga toxins (Stx) Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains producing Stx and AE lesion similar to O157:H7 E. coli causing haemorrhagic enterocolitis EPEC, VTEC and EHEC

4 4 Production in the intestines Crossing of the epithelium through the enterocytes Reach the blood stream Active in vivo on the endothelial cells of the blood vessels Stop the protein synthesis in the target cells Oedemas and haemorrhages Shiga toxins Attachment to the microvilli of the enterocytes Injection of bacterial effectors into the enterocytes Re- and dis-organization of the enterocyte cytoskeleton Effacement of the microvilli of the enterocytes Inflammatory reaction with cell infiltration, oedema of the mucosa and loosening of the tight junctions Attaching/Effacing lesion

5 55 - hommes Infection asymptomatique Entérocolite: diarrhée Entérocolite hémorragique: diarrhée abondante et hémorragique Syndrome hémolytique urémique Syndrome purpura thrombotique thrombocytopénique - bovins veaux (jusquà 3 mois): diarrhée adultes: portage asymptomatique - autres ruminants: portage asymptomatique - autres espèces : de manière anecdotique Pathologies des EHEC

6 66

7 7 young calves humans adult ruminants EHEC Epidemiology of EHEC EHEC ? ? ? ? ?

8 8 RuminantsHumans Meat, milk Direct contacts Intestinal content, faeces Dung, manure SoilsWaters Vegetables, fruits Faeces Swimming waters Drinking water ?? Epidemiology of EHEC

9 9 Enterohemorrhagic [EHEC] / Verotoxigenic [VTEC] Escherichia coli en production primaire Dr Hein Imberechts Laboratoire Nationale de Référence pour les E. coli zoonotiques, santé animale

10 10 Contenu Définitions Clinique Virulence des VTEC VTEC chez les ruminants Le diagnostic Programmes officiels, monitoring Mesures Portage de VTEC en Belgique et en Europe

11 11 Définitions VTEC: produisent vérocytotoxines (VT), ou « Shiga toxins » (Stx) [voir Shigella dysenteriae] EHEC –VTEC considéré très pathogène pour lhomme –Mais: pas toujours HUS, HC (maladie grave)

12 12 Définitions E. coli O157 –Non-O157: e.a. O26, O91, O103, O111, O145 Typique – atypique: réfère à la production des lésions A/E et (ou) la présence du plasmide EHEC E. coli zoonotiques - autres VTEC –Problème de diagnostic

13 13 Clinique UE: 1.2 cas par habitants (EFSA, 2005) Infection –Aliments contaminés –Eaux –Contact direct & indirect: ruminants infectés –Contact avec personnes infectées Clinique –HUS, HC, BD –Diarrhée, mal de ventre, sans symptômes

14 14 Virulence Facteurs de virulence –Toxines Stx1, Stx2 –Adhésines Eae –Locus of Enterocyte Effacement –Plasmide, Ehx (marqueur de virulence) –Autres

15 15 LEE locus Nataro and Kaper 1998 Virulence

16 16 Virulence Stx: encodé par phage, donc pas stable Variants

17 17 Virulence Séropathotype: combination de sérotype, stx subtypes, présence des facteurs de virulence et association avec maladie chez lhomme –Seropathotype A strains (VTEC O157) have a high relative incidence, commonly cause outbreaks and are associated with HUS –Seropathotype B strains (O26:H11, O103:H2/NM, O111:NM, O145:NM, O121:H19) have a moderate incidence and are uncommon in outbreaks, but were associated with HUS –Seropathotype C strains (O91, O104 and O113 all of H-type 21) are associated with HUS, but these strains were of low incidence and rarely caused outbreaks –Seropathotypes D and E are not HUS-associated and are uncommon in man or found only in non-human sources

18 18 Virulence « Deux lignées » de VTEC O157; une plus associée avec maladie chez lhomme Variants de Stx & pathologie Conclusion: à lheure actuelle, on ne peut pas identifier une souche pathogène pour lhomme

19 19 VTEC chez les ruminants VTEC et diarrhée –Souvent stx1 VTEC sans signes cliniques Implications pour le diagnostic et le monitoring

20 20 Le diagnostic Isolement E. coli O157 –mTSB+novobiocine; IMS (DynaBeads); CT- SMAC; agglutination Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey Méthode normalisée et validée (ISO 16654) Autres –En développement –Détection moléculaire: gènes appartenant à plusieurs souches

21 21 Le diagnostic Confirmation par sérotypie –Antigène O: LPS, sucres –Antigène H: flagelles, protéines –Agglutination Confirmation par biochimie (O157) – -glucoronidase (négative) –Sorbitol (fermentation lente)

22 22 Le diagnostic Confirmation par PCR –Gènes: facteurs de virulence –Polymorphismes Vérotoxines Stx1, Stx2 Adhésine Eae (,,, …) Protéines du LEE Typage (tracing) –PFGE: génome –Stx1, Stx2 –Phage

23 23 Le diagnostic Tests sérologiques (ELISA) –Anti-O157 –Anti-Stx –Anti-Eae

24 24 Programme … … officiel en production primaire –Il ny en a plus depuis 2005 Avant 2005 –Détection à labattoir –Tracing back de la ferme dorigine (Sanitel) –Echantillonnage 20% entre 6 mois et 2 ans, aliment, poussière PCR –Mesures dhygiène sur la ferme

25 25 Programme Site de colonisation ? –Echantillonnage spécifique ? En fonction de –la nourriture –la saison –… Plusieurs souches sur une exploitation

26 26 Monitoring Données comparables ? Evolution ? Infections chez lhomme & détection de VTEC pathogènes: –la population animale –les carcasses et viande à labattoir –les échantillons environnementaux qui peuvent être contaminés par matière fécale et eaux –ready to eat foods qui peuvent être contaminés par matières fécales Sérotypes: E. coli O157, O26, O91, O103, O111 et O145

27 27 Monitoring Recommandation EFSA –Caractériser toute VTEC (animaux, aliments, environnement), par méthodes harmonisées Sérotypage Lysotypie (VTEC O157) Typage gènes vtx et eae –Typage moléculaire PFGE –Collection centralisée et comparaison des résultats

28 28 Monitoring chez les animaux Lisolement de VTEC indique la présence ubiquitaire dans lenvironnement Bovins > moutons & chèvres > animaux de compagnie, faune sauvage, … >>> porc, volaille, … Tenir compte des différences locales –La population –Les pratiques agricoles –La consommation alimentaire, …

29 29 Monitoring chez les animaux Problème: lexcrétion de VTEC O157 –Transitoire –Différences quantitatives –Influencée par lâge et lalimentation Monitoring est lourd et cher Utile en cas de risque, p.ex. ferme ouverte au grand public

30 30 Mesures GHP à labattoir et à latelier de découpe, monitoring pour indicateurs comme Enterobacteriaceae et E. coli Procédures HACCP pour aliments susceptibles à être contaminés Monitoring des bovins, de la ferme, de laliment en cas détudes spécifiques Recommandation: dabord E. coli O157, puis dautres sérotypes, avec des méthodes harmonisées

31 31 Portage de VTEC EFSA: zoonoses, BIOHAZ Enternet net_menu.htmhttp://www.hpa.org.uk/hpa/inter/enter- net_menu.htm PubMed AFSCA, Zoonotic agents in BE 005_S.pdfhttp://www.favv.be/home/pub/doc07/Report_TS_2 005_S.pdf

32 32 Portage de VTEC Belgique –Peu de données, sauf aux abattoirs Europe –Chiffres sont confus

33 33 Escherichia coli entéro-hémorragique chez lhomme Christiane Duchesnes Janvier 2008

34 34 Escherichia coli Pathotype: EHEC Sérotypes: O157:H7; le plus fréquent O26, O103, O111, 0145, … Facteurs de virulence adhésion aux entérocytes et effacement des microvillosités sécrétion de toxines: Stx1 et Stx2 Réservoir Tube digestif de lhomme et de lanimal (ruminants) Contamination Ingestion: aliments contaminés par MF, crus ou peu cuits (hamburgers, produits à base de lait cru, légumes, …) Incidence Varie selon le pays; <2 cas/ hab/an

35 35 Physiopathologie EHEC Toxine Microangiopathies (surtout rénales) Diarrhée Tube digestif séro-sanglante

36 36 Tableau clinique Diarrhée sérosanglante Colite hémorragique Douleurs abdominales Peu de fièvre Cas groupés souvent liés à la restauration rapide

37 37 Traitement Risques ++: enfants 65 ans 10% Syndrome Hémolyse-Urémie (SHU) (incidence: 0,5 cas/ enfants<15ans /an) Rare Purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) Réhydratation Antibiotiques à éviter Complications

38 38 MICROANGIOPATHIE (lésions endothéliales) INFLAMMATION Fragmentation des GR dans les lésions: anémie hémolytique Hb basse, réticulocytes et schizocytes Pâleur, (sub)ictère MICROTHROMBI Thrombopénie par consommation, pétéchies, purpura INSUFFISANCE RENALE AIGUË Oligo-anurie, oedèmes, prise de poids, hypertension artérielle, urémie SHU (= HUS)

39 39 ¾ cas évoluent vers la guérison < 5% mortalité Séquelles possibles: IRC HTA SHU traitement SHU évolution Symptomatique: Dialyse péritonéale

40 40 Evaluation du risque lié aux VTEC et E. coli O157 entérohémorragiques dans les aliments en Belgique Georges Daube Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Microbiologie des Denrées Alimentaires Sart-Tilman, bât. B43bis 4000 Liège tél fax Avec laide de : Katelijne Dierick, ISP

41 41 Plan de lexposé Introduction –Evaluation des risques –Méthodes de recherche dans les aliments Appréciation du risque dans la filière « viande » –Identification du danger –Evaluation de lexposition –Caractérisation du danger –Caractérisation du risque Mesures de prévention dans la filière « viande » Problématique des critères microbiologiques Conclusions

42 42 Evaluation des risques partie intégrante de lanalyse des risques Analyse des risques Evaluation des risques Evaluation scientifique de la probabilité doccurrence et de la gravité deffets néfastes pour la santé résultant de lexposition de lhomme à des dangers présents dans les aliments. Evaluation des risques Gestion des risques Communication des risques 1. Identification du danger 2. Evaluation de lexposition 3. Caractérisation du danger 4. Caractérisation du risque

43 43 Principes des méthodes de recherche Pas de méthodes simples, standardisées et validées pour la recherche de VTEC non-O157 dans les aliments doù pas de statistiques exploitables Aucune méthode disponible pour les dénombrements Pistes envisagées (recherches en cours) -séparation immuno-magnétique basée sur le sérotype -Besoin de milieux disolements spécifiques -Besoin de confirmer la virulence

44 44 Principes des méthodes de recherche Propriétés biochimiques des E. coli O157:H7 semblables aux autres E. coli excepté: -Résiste au tellurite et au céfixime -Ne fermente pas le sorbitol en 24 h -Ne produit pas de β-glucuronidase La sélection et la différentiation biochimique sont basées sur ces caractéristiques

45 45 Méthode-type de recherche de VTEC O157 dans les aliments Préenrichissement Enrichissement (Détection immunologique) Immuno-concentration (VIDAS ICE ou IMS- Dynal) Isolement Identification biochimique Agglutination Confirmation des facteurs de virulence par PCR

46 46 Schéma - Méthode Vidas ECO (1)

47 47 Schéma - Méthode Vidas ECO (2)

48 48 Concentration dE. coli O157 par capture par des billes immunomagnétiques

49 49 Schéma - Méthode Vidas ECO (3) Confirmation

50 50 Centre de référence: UZ-Brussels Dr. Denis Pierard Détection des gènes codants pour les facteurs de virulence - Vérocytotoxines (shigatoxines stx1 et 2) - Entérohémolysine - eaeA (intimine)

51 51 EVALUATION QUANTITATIVE DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE

52 52

53 53 1. Identification du danger 1.1. EHEC O157 terminologie Escherichia coli : espèce type du genre Escherichia appartenant à la famille des entérobactériacées. VTEC-STEC : E.coli vérocytotoxinogène ou producteurs de toxine « Shiga » – souches produisant des toxines actives sur les cellules Véro (toxines VT ou stx). EHEC : E.coli entérohémorragique. –E.coli vérocytotoxinogène qui possède les mêmes propriétés cliniques (SHU, entérocolite hémorragique), épidémiologiques et pathogéniques (propriétés attachantes/effaçantes, plasmide 60 MDa) que le clone épidémique O157:H7. EHEC O157 : E.coli entérohémorragique de sérotype O157. A lorigine de la définition du groupe EHEC et manifestant la plus forte vitulence et le plus fort potentiel épidémique.

54 Physiologie (1) Température: –Tmin : 6-7°C; Topt : 40°C; Tmax : 45,5°C –D 55°C : 20; D 60°C : 3; D 65°C : 0,36; (recommandation 70°C 2) –Pas ou peu deffet de la congélation pH: –pHmin : 4,2 (HCl) - 5,5 (Ac. acétique); pHopt : 6,9; pHmax : 9,4 –Résistance/tolérance à lacidité (adaptation) Activité de leau (NaCl): –a W min : 0,953; a W opt : 0,995 Conditionnement: –Peu ou pas deffet du sous-vide ou de latmosphère modifiée

55 Physiologie (2) Additifs: –Nitrites: efficace à pH < 5,5 –Acides organiques –Bactériocines –Phosphates Rayonnements: –ionisation –RX –UV Hautes pressions Ozone

56 Symptomatologie

57 57 Résultat des surveillance VTEC en Belgique chez lhomme ( ) SerotypeFreq% O1574, O O O O O SerotypeFreq% O O O O Other Total6,

58 Mode de transmission Indirect –Consommation daliments contaminés : - denrées alimentaires dorigine animale (bovine) : « hamburgers » insuffisamment cuits (USA), salami, lait cru, produits laitiers non pasteurisés … - denrées alimentaires dorigine végétale –Consommation deau de boisson contaminée. –Baignade, pâture contaminée. Direct –Transmission directe de lhomme à lhomme ou de lanimal à lhomme.

59 59 AFSSA 2003 Modes de transmission

60 60 AFSSA 2003 Aliments associés

61 61 Prévalence EHEC O157 en Belgique (source ULg, RUG, AZ-VUB et IEV) Coprocultures humaines: 1% EHEC et 0,2 % EHEC O157; lysotypes variés. Coprocultures humaines: 1% EHEC et 0,2 % EHEC O157; lysotypes variés. Coprocultures bovines à labattoir : 6% EHEC O157 ( ). Coprocultures bovines à labattoir : 6% EHEC O157 ( ). Carcasses de boeuf: Carcasses de boeuf: en 1997 (400 cm 2 ): 9/6010 (0,15 %); en 1997 (400 cm 2 ): 9/6010 (0,15 %); en 1999 (1.600 cm 2 ): 16/1620 (1 %); en 2002 (1.600 cm 2 ): 13/1215 (1,1%) en 1999 (1.600 cm 2 ): 16/1620 (1 %); en 2002 (1.600 cm 2 ): 13/1215 (1,1%) en 2000 (1.600 cm 2 ): 7/1501 (0,5%); en 2003 (1.600 cm 2 ): 10/1479 (0,7%) en 2000 (1.600 cm 2 ): 7/1501 (0,5%); en 2003 (1.600 cm 2 ): 10/1479 (0,7%) en 2001 (1.600 cm 2 ): 13/1388 (0,9%); en 2004 (1.600 cm 2 ): 18/1319 (1,4%) en 2001 (1.600 cm 2 ): 13/1388 (0,9%); en 2004 (1.600 cm 2 ): 18/1319 (1,4%) Découpe de boeuf (25g) : en 2002: 0/222 (0%); en 2003: 2/285 (0,7%); en 2004: 2/244 (0,8%) Découpe de boeuf (25g) : en 2002: 0/222 (0%); en 2003: 2/285 (0,7%); en 2004: 2/244 (0,8%) Viande hachée de boeuf (25g) : en 1999: 1 / 984 (0,1%); en 2000: 1/487 (0,2%); en 2001: 0/298 (0%); en 2002 : 0/297 (0%); en 2003 : 5/298 (1,7%); en 2004 : 1/332 (0,3%) Viande hachée de boeuf (25g) : en 1999: 1 / 984 (0,1%); en 2000: 1/487 (0,2%); en 2001: 0/298 (0%); en 2002 : 0/297 (0%); en 2003 : 5/298 (1,7%); en 2004 : 1/332 (0,3%) Autres viandes (veau, porc, volailles, lapins) : 0 EHEC O157 /1.500 Autres viandes (veau, porc, volailles, lapins) : 0 EHEC O157 /1.500 Lait cru : 0/123 (2006); Fromage au lait cru de vache : 5/271 (1,8%) (2006) Lait cru : 0/123 (2006); Fromage au lait cru de vache : 5/271 (1,8%) (2006)

62 62 Evaluations internationales

63 63 USDA 2001 Evaluation du risque « viande hachée de bœuf »

64 64 2. Evaluation de lexposition Principales étapes à envisager Contamination Contamination croisée Multiplication Dilution Destruction

65 Elevage La prévalence dexploitations positives est très variable La prévalence intra-exploitations est aussi très variable Le type de bétail (veaux, taurillons, vaches) La dynamique temporelle dans les exploitations (effet alimentation, saison, etc.) Lexcrétion à labattoir et sa dynamique temporelle sont similaires à celles observées dans les élevages

66 Elevage: données belges Informations manquantes - Collecter des informations concernant le type délevage et dalimentation, lâge des animaux, les saisons, les probiotiques, les immunisations et à partir de celles-ci en évaluer le risque différentiel. - Réaliser des études concernant le nombre de EHEC O157 / gr de matières fécales.

67 Abattoir: données belges Prévalence de carcasses contaminées sur cm 2 par EHEC O157 : 1,01 % (n = 8.522) Prévalence de carcasses contaminées sur 400 cm 2 par EHEC O157 : 0.15 % (n = 6.010) Nombre de EHEC O157 : - 1 ufc/cm 2 et 200 ufc/cm % des + avec < 1 ufc/400 cm 2. Nombre dE. coli /cm 2 : 95% < 100 ufc / cm 2. 90% < 10 ufc / cm 2. 70% < 1 ufc / cm 2. 45% < 1 ufc / 10 cm 2.

68 Abattoir: données belges Informations manquantes - Préciser les niveaux de contamination - Investiguer les facteurs de contamination croisée en fonction du type dabattoir. -Tenir compte de linfluence des fortes contaminations fécales accidentelles à labattoir.

69 Découpe et hachage: données belges La prévalence des morceaux de découpe contaminés par EHEC O157 est faible : 0,5% (n = 751). La prévalence de EHEC O157 dans la viande hachée de bœuf est de 0,3% (n = 2696). 75 % des viandes hachées de boeuf contiennent < 100 cfu/g

70 Découpe et Hachage: données belges Informations manquantes - Préciser limportance relative des filières belges de production. - Déterminer en termes daugmentation, de stabilisation ou de diminution de EHEC O157 linfluence des pratiques suivantes : –Lutilisation ou non de la congélation avant le hachage.

71 Découpe et Hachage: données belges –Le travail à partir de petits ou gros morceaux de découpe. –Le nombre danimaux différents intervenant au sein dun même lot de hachage. –Lutilisation ou non de chutes de découpe en boucherie. –La possibilité de contamination dorigine humaine différente dune filière à lautre.

72 Stockage, Conditionnement et Distribution: données belges Température moyenne / filet américain / supermarchés : 5 °C. Température / comptoirs réfrigérés : 70% supermarchés : t° 7°C. DLC : 48 heures. Conditionnement : barquette en frigolite ou en plastique avec film perméable à lair. Taille du conditionnement : grs, 500grs. pH du filet américain préparé :

73 Consommation: données belges Le % de conditionnements de viande hachée contaminés : 0 EHEC O157 sur 194 échantillons. La quantité de filet américain consommé / an : 2 kg 320. La consommation de hamburgers insuffisamment cuits est ignorée Le nombre estimé de consommateurs de filet américain: La quantité estimée de filet américain consommé / repas : 150 g. Le nombre moyen de repas de filet américain par an : 15.

74 74 3. Caractérisation du danger Relation dose-réponse Dose infectieuse faible +/-50 cellules ingérées 4. Caractérisation du risque: données belges Viande hachée de bœuf 0.30 % EHEC O157 + Nombre de repas / an 15 Population globale cas de SHU (=1996) 4 cas mortels Carcasses de bœuf 1,01 % EHEC O ,82 % < 1 ufc/400 cm 2 - 0,18 % > 1 ufc/400 cm 2 Taille de la portion consommée par repas 150 g

75 4. Caractérisation du risque: données belges

76 76 PREVENTION DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE

77 77 Points essentiels à maîtriser Elevage : portage, niveau de portage. Abattage : prévalence de carcasses contaminées, niveau de contamination. Découpe, hachage : prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque.

78 78 Points essentiels à maîtriser Traitement des carcasses avec fortes contaminations fécales: –Parage des contaminations visibles –Déclassement des « accidents déviscération » –Perte dagrément pour « mauvais » abattoirs Tests systématique de carcasses pour « filet américain » Réduction du niveau de contamination par EHEC O157 en début de filière

79 79 Points essentiels à maîtriser Elevage : portage, niveau de portage. Abattage : prévalence de carcasses contaminées, niveau de contamination. Découpe, hachage : prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque.

80 80 Points essentiels à maîtriser Absence de consommation de viande crue de bœuf par les populations à risque: –Enfants moins de 15 ans –Personnes âgées

81 81 Critères microbiologiques Pas de critères dans le règlement (CE) N°2073/2005 Limites dactions de lAFSCA pour contrôles officiels:

82 82 Critères microbiologiques Avant de fixer des critères européens (DG SANCO) Avis 2007 de lEuropean Food Safety Authority (EFSA): -Priorité = VTEC O157 -Surveillance abattoir -Surveillance chute de découpe -Méthodes à développer pour VTEC non-O157

83 83 Conclusion Bonne connaissance de la prévalence, du niveau de contamination d E.coli O157 à tous les niveaux de production du filet américain. Comment établir un lien entre ces différentes étapes ? - Modélisation mathématique probabiliste. - Manque dexperts indispensable pour définir les données adéquates à introduire dans le modèle. - Besoin de données quantitatives. Prévention de EHEC au sein dun aliment cru est difficile. - Mise en place de programmes dassurance de sécurité alimentaire à chaque étape de production dont surtout labattoir: BPH - HACCP - Information du consommateur. Besoin de critères uniformes européens


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