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Emergent effects of heavy metal pollution at a population level: Littorina brevicula a study case Sook-Jung Kim a, Mauricio Rodriguez-Lanetty a, Jae-Hwa.

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1 Emergent effects of heavy metal pollution at a population level: Littorina brevicula a study case Sook-Jung Kim a, Mauricio Rodriguez-Lanetty a, Jae-Hwa Suh b, Jun-Im Song a * a Department of Life Sciences, Ewha Womans University, Seoul , South Korea b Environmental Risk Assessment Division, Environmental Risk Research Department, National institute of Environmental Research, Inchun , South Korea Curti Cécile Suroy Maxime M1 Biologie et écologie marine

2 État des connaissances: Littorina brevicula, Philippi, 1844 Littorina brevicula Lexposition aux contaminants a des effets directs ou indirects sur la génétique des populations. Bon indicateur biologique du niveau de pollution aux métaux lourds. Daprès Kang et al, 2000 Émergence de lindustrialisation et de lurbanisation sur les côtes coréennes, notamment depuis les années Résistance notable de L.brevicula aux métaux lourds. Daprès Ryu et al, 2002 Daprès Bickham et al, 1994

3 Étude a proprement parlé Objectif : étudier la diversité génétique de L.brevicula entre des sites non pollués et des sites pollués. Utilisation de deux marqueurs : lADNmt cyt b et lADNmt ND6. Échantillonnage en décembre 1998 sur 6 sites. Sites déchantillonages dans la baie de Masan et la baie dOnsan sur la côte Sud-Est de la Corée du Sud Dokdong Isudo Tangsa Chundo Daejung-chun Jin-ha

4 Sites non pollués Sites pollués Dokdong Isudo Tangsa Chundo Daejung-chun Jin-ha Mesure des concentrations en métaux lourds dans les différents compartiments A partir du tableau de données 1 Kim et al, 2003

5 Les différents haplotypes obtenus 7 haplotypes obtenus pour le marqueur cyt b (notés A, B, C, D, E, F, G) 14 haplotypes obtenus pour le marqueur ND6 (notés 1, 2, 3…..13, 14) A partir des tableaux de données 2 et 3 Kim et al, 2003

6 Analyse de clade emboités (NCA) ND6 Réseau non raciné Structure en clades emboîtées 2-1 Réseau non raciné Cyt b Groupement en fonction de lhistoire évolutive des haplotypes Regrouper tous les haplotypes pour former des clades Analyse contingente : association clade/localité Daprès Templeton, 1995 La distribution des haplotypes de ND6 a une relation avec létat de pollution des sites Marqueur ADNClade PopulationsGroupes Statistique permutationnelא ²Probabilité Statistique permutationnel א ²Probabilité cyt b ND AMOVA : ne différencie pas les populations

7 Conclusions Aucune différenciation génétique pour le marqueur cyt b entre les populations des sites pollués et non pollués A contrario, le marqueur ND6 met en évidence une diversité génétique significative et une structure de population différente selon létat de pollution du site : - diversité haplotypique diminuée dans les sites pollués - lAMOVA permet de mettre en évidence un fort flux de gènes - la structure génétique déduite de lanalyse de clades emboités indique que ce flux a certainement été limité Les changements dans la diversité des haplotypes, leurs distributions et leurs fréquences pourraient être des effets émergeants provenant dune pollution aux métaux lourds au niveau de la population. Daprès Kovatch et al, 2000

8 CRITIQUES Nombre de sites étudiés insuffisant Daprès Kang et al, 1999 Nombre dorganismes étudiés pour chaque site insuffisant Les mêmes auteurs : pas de différenciation haplotypique entre les différentes populations de L.brevicula sur les côtes coréennes Daprès Kim et al, 2003, Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters

9 Sites CadmiumZinc eau de mer (μg/L)sédiment (μg/g)organisme (μg/g)eau de mer (μg/L)sédiment (μg/g)organisme (μg/g) sites non pollués Tangsa0.011± ± ± ± Jin-ha0.009 ± ± ± ± 1.00 Isudo0.007 ± ± ± ± sites pollués Chundo0.045 ± ± ± ± Daejung-chun1.705 ± ± ± ± 1.00 Dokdong0.01 ± ± ± ± 3.94 Sites CuivrePlomb eau de mer (μg/L)sédiment (μg/g)organisme (μg/g)eau de mer (μg/L)sédiment (μg/g)organisme (μg/g) sites non pollués Tangsa0.3 ± ± ± ± 7.13 Jin-ha0.12 ± ± ± 0.16 Isudo0.17 ± ± ± ± 3.85 sites pollués Chundo1.75 ± ± ± ± Daejung-chun24.6 ± ± ± 0.89 Dokdong0.61 ± ± ± ± 3.30 Concentrations en métaux lourds (Cd, Zn, Cu et Pb) dans les différents compartiments échantillonés DONNEES??? Même motif dabsence de données

10 Daprès Petit, 2008 papiers utilisant la méthode NCPA depuis 2000 Papiers sur la NCPA % de papiers en phylogéographie La NCA, peu fiable ? En Août 2007, 1600 citations de la méthode de Templeton Knowles & Madison (2002), Panchal & Beaumont (2007), Petit & Grivet (2002) aboutissent à la même conclusion : la méthode NCPA retourne trop de faux positifs Raison avancée : les tests de permutation utilisés remanient les individus et pas les populations. Templeton Petit … je suggère que la méthode ne soit pas trop utilisée jusquà ce quelle ait été plus minutieusement évalué et de façon critique, ce qui devrait être facilité par les nouvelles procédures automatisées.

11 Merci de votre attention

12 Bibliographie Bickham, J.W., Sandhu, S., Hebert, P.D.N., Chikhi, L., Athwal, R., Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research 463, 33–51. Kang, S.G., Choi, M.S., Oha, I.S., Wright, D.A., Koh, C.H Assessment of metal pollution in Onsan Bay, Korea using Asian periwinkle Littorina brevicula as a biomonitor. The Science of the Total Environment. 234, Kang, S.G., Wright, D.A., Koh, C.H., Baseline metal concentration in the Asian periwinkle Littorina brevicula employed as a biomonitor to assess metal pollution in Korean coastal water. The Science of the Total Environment 263, Kim, S.J., Rodriguez-Lanetty, M., Song, J.I., Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters. Hydrobiologia 505, 41–48. Lee SH, Lee KW. Heavy metals in mussels in the Korean coastal waters. J Oceanol Soc Korea 1984;19: Lee IS, Song JI, Park KS, Choe BL, Rho BJ. Bioaccumulation of trace metals by mussel Mytilus edulis from Korean coast. Korean J Ecol 1995;18: Lee IS, Rho BJ, Song JI, Kim EJ. The concentrations of heavy metals in sediment, seawater and oyster Crassostrea gigas in coastal regions of industrial complex in Korea. Korean J Ecol 1996;19: Nadig, S.G., Lee, K.L., Adams, S.M., Evaluating alterations of genetic diversity in sunfish populations exposed to contaminants using RAPD assay. Aquatic Toxicology 43, 163–178. Nevo, E., Noy, R., Lavie, B., Beiles, A., Muchtar, S., Genetic diversity and resistance to marine pollution: theory and practice. Biological Journal of the Linnean Society 29, 139–144. Park, K.S., Song, J.I., Choe, B.L., Kim, S.J., Amylase polymorphism of Littorina brevicula from polluted and unpolluted sites, Korea. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 63, 633–638. Petit, R.J., The coup de grâce for the nested clade phylogeographic analysis. Molecular Ecology 17, Reid, D.G., Systematics and evolution of Littorina. Dorset Press, Dorchester, UK. Street, G.T., Lotufo, G.R., Montagna, P.A., Fleeger, J.W., Reduced genetic diversity in a meiobenthic copepod exposed to a xenobiotic. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 222, 93–111. Templeton, A.R., Nested clade analysis : an extensively validated method for strong phylogeographic inference. Molecular Ecology. Templeton, A.R., Crandall, K.A., Sing, C.F., A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. Genetics 132, 619–633. Templeton, A.R., Routman, E., Phillips, C.A., Separating population structure from population history: a cladistic of the geographical distribution of mitochondrial DNA haplotypes in the tiger salamander, Ambystoma tigrinum. Genetics 140, 767–782. Nous remercions Mr Nevo pour nous avoir gracieusement envoyé lune de ses publications et Mr Aurelle pour nous avoir orienté dans notre analyse critique.

13 Bickham, J.W., Sandhu, S., Hebert, P.D.N., Chikhi, L., Athwal, R., Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research 463, 33–51. Kang, S.G., Choi, M.S., Oha, I.S., Wright, D.A., Koh, C.H Assessment of metal pollution in Onsan Bay, Korea using Asian periwinkle Littorina brevicula as a biomonitor. The Science of the Total Environment. 234, Kang, S.G., Wright, D.A., Koh, C.H., Baseline metal concentration in the Asian periwinkle Littorina brevicula employed as a biomonitor to assess metal pollution in Korean coastal water. The Science of the Total Environment 263, Kim, S.J., Rodriguez-Lanetty, M., Song, J.I., Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters. Hydrobiologia 505, 41–48. Lee SH, Lee KW. Heavy metals in mussels in the Korean coastal waters. J Oceanol Soc Korea 1984;19: Lee IS, Song JI, Park KS, Choe BL, Rho BJ. Bioaccumulation of trace metals by mussel Mytilus edulis from Korean coast. Korean J Ecol 1995;18: Lee IS, Rho BJ, Song JI, Kim EJ. The concentrations of heavy metals in sediment, seawater and oyster Crassostrea gigas in coastal regions of industrial complex in Korea. Korean J Ecol 1996;19: Nadig, S.G., Lee, K.L., Adams, S.M., Evaluating alterations of genetic diversity in sunfish populations exposed to contaminants using RAPD assay. Aquatic Toxicology 43, 163–178. Nevo, E., Noy, R., Lavie, B., Beiles, A., Muchtar, S., Genetic diversity and resistance to marine pollution: theory and practice. Biological Journal of the Linnean Society 29, 139–144. Park, K.S., Song, J.I., Choe, B.L., Kim, S.J., Amylase polymorphism of Littorina brevicula from polluted and unpolluted sites, Korea. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 63, 633–638. Petit, R.J., The coup de grâce for the nested clade phylogeographic analysis. Molecular Ecology 17, Reid, D.G., Systematics and evolution of Littorina. Dorset Press, Dorchester, UK. Street, G.T., Lotufo, G.R., Montagna, P.A., Fleeger, J.W., Reduced genetic diversity in a meiobenthic copepod exposed to a xenobiotic. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 222, 93–111. Templeton, A.R., Nested clade analysis : an extensively validated method for strong phylogeographic inference. Molecular Ecology. Templeton, A.R., Crandall, K.A., Sing, C.F., A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. Genetics 132, 619–633. Templeton, A.R., Routman, E., Phillips, C.A., Separating population structure from population history: a cladistic of the geographical distribution of mitochondrial DNA haplotypes in the tiger salamander, Ambystoma tigrinum. Genetics 140, 767–782. Bibliographie

14 L.brevicula, Philippi, 1844 Petit gastropode herbivore, abondant sur les rivages rocheux en Corée. Grazer dominant. Taille minimale de maturation sexuelle : 6.5 mm (longueur de coquille). Littorina brevicula Prolifération en Hiver, T°C de leau < 12°C (Décembre à Avril). Développement embryonique : 7 jours dans coquille. Larve cilié pélagique.

15 LADN mitochondrial et les marqueurs cyt b et ND6 ADNmt = taux de mutation élevé du à sa petite taille = marqueur privilégié pour létude de la biodiversité moléculaire. Cyt b code pour un composant de la chaîne respiratoire et est impliqué dans le transport délectrons. ND6 code pour la sous-unité déshydrogénase 6 de la NADH responsable de la phosphorylation oxydative. Fait partie dun gros complexe enzymatique qui gère le transport délectrons de la NADH vers lubiquinone.

16 Complément sur lanalyse contingente test khi² calcul de la valeur critique à laide de la table du א ² et du calcul du degré de liberté : valeur critique = 0.05 probabilité : fréquence avec laquelle א² stat > ou = א² obs. Cette probabilité nest significative que si elle est inférieure à la valeur critique. Marqueur ADN Clade PopulationsGroupes Statistique permutationnelא ²Probabilité Statistique permutationnel א ²Probabilité cyt b ND

17 Daprès Petit, 2008 Population bottleneck La NCA, peu fiable ? En Août 2007, 1600 citations de la méthode de Templeton Knowles & Madison (2002), Panchal & Beaumont (2007), Petit & Grivet (2002) aboutissent à la même conclusion : la méthode NCPA retourne trop de faux positifs Raison avancée : les tests de permutation utilisés remanient les individus et pas les populations. Templeton Petit Si on veut tester lexistence dune structure génétique spatiale par permutation, il faut remanier les populations. Sinon, les processus affectant les fréquences des haplotypes, comme les événements bottleneck, sont confondus avec les processus historiques = trop de faux positifs

18 LAMOVA Met en évidence les relations génétiques entre les différents niveaux de subdivisions hiérarchiques 2 niveaux hiérarchiques établis : les groupes (pollués et non pollués) et les populations Matrice de distance génétique calculée en utilisant le modèle à 2 paramètres de Kimura Résultats de lAMOVA parmi les populations de L.brevicula utilisant les données des ADNmt cyt b et ND6 différences non significatives parmi les groupes et parmi les populations au sein des groupes la plupart de la variance moléculaire est expliqué au sein des populations (95.5%)

19 LAMOVA Tiré de Excoffier et al publié en 1992 Technique illustrée par létude de lADNmt humain et de ses sites de restriction Extrême-Orient Afrique de louest Europe Moyen-Orient Amérique centrale Pour chaque population, les haplotypes trouvés sont montrés en cercles noirs

20 Comparaison des cibles, des résolutions et des coûts des différentes méthodes pour surveiller la diversité génétique au sein des populations naturelles. Daprès Bickham et al, 1994 Les différentes méthodes et leur coût en 1994 Les auteurs privilégient dans notre article lutilisation de la NCA (malgré les problèmes mis en évidence). Cette analyse nécessite des données haplotypique qui sont obtenues par ces différentes méthodes :

21 Schéma des relations parmi les facteurs relié à la contamination chimique de lenvironnement avec la diminution de la diversité génétique des populations. Daprès Bickham et al, 1994

22 Le modèle à 2 paramètres de Kimura Prend en compte le nombre de substitutions nucléotidiques pour estimer la distance évolutive entre deux séquences. Si un site homologue est occupé par des bases différentes, mais que les deux sont des purines ou des pyrimidines, la différence est de type I Si au contraire les bases différentes ne sont ni toutes deux des purines ou des pyrimidines, la différence est de type II K = - (1/2) ln {(1 - 2P - Q) Les lettres P et Q représentent les fractions de sites nucléotidiques montrant respectivement des différences de types I et II entre deux séquences comparées

23 Le site dUlsan (Dokdong)

24 Isozyme polymorphism as monitoring of marine environments: The interactive effect of Cadmium and Mercury pollution on the shrimp, Palaemon elegans (Ben-Shlomo et Eviatar Nevo) Isozymes=enzymes qui diffèrent par leur séquence aminoacide mais qui catalysent la même réaction chimique La contamination par le Cd et le Hg agit comme un contaminant spécifique (ne fait quun) Inhibition compétitive des métaux lourds Hg et Cd avec le Mg au site actif de la PGM "il est urgent de trouver lespèce optimale […] afin destimer les effets de la pollution à la fois quantitativement et qualitativement et lutiliser pour sauvegarder la qualité de lenvironnement marin 1988


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