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Laboratoire « Bases moléculaires de la réponse aux xénobiotiques» Bahïa EL ABED, 3ème1 du 12 au 16 décembre 2011.

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1 Laboratoire « Bases moléculaires de la réponse aux xénobiotiques» Bahïa EL ABED, 3ème1 du 12 au 16 décembre 2011

2 Sommaire -Présentation de lentreprisePrésentation de lentreprise -Fonctionnement de lentrepriseFonctionnement de lentreprise -Culture de cellulesCulture de cellules -Compte-rendu hebdomadaireCompte-rendu hebdomadaire -Description des tâches accompliesDescription des tâches accomplies -ConclusionConclusion

3 Présentation de lentreprise U – 775 INSERM est un laboratoire public où lon réalise des recherches scientifiques pour étudier différents sujets de recherche: le cancer du colon, du poumon, la transplantation rénale ( = du rein), le métabolisme au niveau du foie et les xénobiotiques…le métabolisme xénobiotiques Ce laboratoire se situe dans luniversité Paris 5 au Centre universitaire des Saints-pères, dans la rue portant le même nom au 6ème arrondissement, à Paris. Suivant

4 Fonctionnement de lentreprise ( ICI ) ( ICI ) Traduction des abréviations ( ICI ) ( ICI ) Traduction des abréviations Suivant

5 Culture de cellules rénales adhérentes Les machines utilisées : -Hotte chimique, incubateur, bain marie, centrifugeuse, microscopeHotte chimiqueincubateur Le matériel utilisé : - gant/blouse, milieu de culture spécifique pour les cellules,des flasques / plaque 6 ou 12 puits, pipette, cellule de Malassez cellule de Malassez La formation requise : Plusieurs conditions possibles: BTS en analyse biologique ou FAC biologie/biochimie Flasques Plaque 6 puits Plaque 12 puits La culture de cellule est un procédé qui a pour but de changer le milieu de culture des cellules (= là où elles grandissent et se nourrissent à la fois). Suite

6 Réalisation dune culture de cellules (suite) 1- décongeler les cellules 2- centrifuger 3- enlever le milieu de culture et en mettre un propre 4- on met les cellules ainsi que le milieu dans la flasque 5- on laisse les cellules dans lincubateur pendant 24 heures 6- ensuite, on change de nouveau de milieu de culture 7- on laisse les cellules dans lincubateur, pendant 72 heures cette fois 8- (les cellules se sont multipliées) on décolle les cellules qui, comme elles sont adhérentes, se sont accrochées à la paroi de la flasque Pour finir, on peut compter le nombre de cellule que lon a avec la technique de la cellule de Malassez. Cellules cultivées en laboratoire U775 INSERM, vues au microscope Suivant

7 Compte rendu hebdomadaire LundiMardiMercrediJeudiVendredi Matin -Visite du laboratoire - début de la manipulation Western Blot - Poursuite de la manipulation -Utilisation de la salle utilisant une technique dimmunofluoresce nce (plus dinformations dans la description des tâches accomplies) - Utilisation de la chambre noire pour achever la manipulation - Autre manipulation pour vérifier si le Western Blot a marché - Nouvelle manipulation: reverse transcription Après- midi - Poursuite de la manipulation - Observation de cellules cultivées - Observation dune manipulation effectuée sur des tissus de cerveau Suivant

8 Description des tâches accomplies Western Blot nous avons cherché à voir les variations dune protéine en fonction des produits quon lui a administré. Le résultat a eut lieu dans une chambre noire, dans le même type que lorsquon développe des photos: cest la chimiofluorescence. Immunofluorescence Nous avons cherché à détecter dans des cellules cultivées dans une plaque 12 puits des colocalisations de protéines différentes ( LC3B et CMHII). Le résultat a eut lieu dans une salle avec un microscope à épifluorescence et le logiciel « NIS element ». Nous avons aperçu des points oranges suite au mélange de deux protéines colorées. (voir si dessous) colocalisationsun microscope à épifluorescence Mesure de la viabilité cellulaire Nous comptons, dans lensemble de cellules cultivées, le nombre de cellules mortes et vivantes, à l aide dune lame contenant la cellule de Malassez, dun microscope, dun compteur manuel, et dun colorant « bleu trypan » qui met en bleu les cellules mortes. Suivant

9 Conclusion Jai beaucoup apprécié cette semaine dimmersion dans le monde du travail, il ma permis de cerner un peu mieux ce qui mattend plus tard à laboutissement de mes études. Jai beaucoup aimé la façon dont les chercheurs travaillent, car ils nont pas dhoraires strictes et font des manipulations sur ce quils souhaitent. Cela a eut une forte influence sur mon projet personnel car je concevais le monde scientifique comme quelque chose dennuyant à la longue. Mais cétait le contraire, japprenais beaucoup de choses et mintriguais sur tout ce qui nétait pas « mathématiquement » correct. Je commençais à réfléchir comme un chercheur ! Jai aussi beaucoup appris du côté de la manipulation, jétais souvent chargée de doser les pipettes (ces dernières étant beaucoup plus élaborées que celles quon utilise généralement qui sont en plastique mou). Je conseillerais à un futur stagiaire de ne pas sinquiéter sil ne sait pas du tout ce quil voudra faire plus tard, comme moi je me suis inquiétée, car le stage ouvre vraiment les yeux sur les directions détude que lon peut prendre ! Sigle des risques biologiques

10 Annexe Cellule de Malassez Cellule de Malassez : cest un grillage qui permet de mesurer la viabilité cellulaire, quon insère dans un microscope. Les cellules mortes sont colorées avec le bleu trypan (un colorant), ce qui leur donne une teinte bleue facilement reconnaissable. Les cellules vivantes sont généralement grises. On réalise le compte uniquement dans les rectangles subdivisés en 20 petits carrés. LincubateurLincubateur : ressemblant à un mini-frigo, il permet de mettre les cellules dans un environnement parfait pour eux : maintenu à 37 degrés. Hotte chimique Hotte chimique : surface de travail stérile permettant de manipuler des cellules sans quelles aient contact avec lair (non stérile) de lextérieur. Milieu de culture : Milieu de culture : cest une substance généralement dans les tons roses-rouges qui nourri les cellules.

11 Lexique Traduction des abréviations: A.I : Assistant ingénieur ATE : Attaché temporaire denseignement C.P : Chargé de Projet C.R : Chargé de Recherche D : Doctorant M2 : Master 2 M.C.U : Maître Conférence Universitaire Post. D: Post Doctorant ( Post = Après ) P.U : Professeur universitaire P.H : Praticien (= Médecin ) Hospitalier Xénobiotiques: Xénobiotiques: Substance étrangère à lorganisme MétabolismeMétabolisme: Transformation dun produit (ici molécule) en un autre produit (ici molécule). ColocalisationColocalisation: Cest lorsque que deux protéines sont collées ensembles dans une cellule et donc quelles fonctionnent ensemble. Microscope à épifluorescence:Microscope à épifluorescence: Cest un microscope qui fonctionne à laide de laser et qui permet de voir des minuscules molécules fluorescentes.


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