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DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE1 VITO LE PHENOTYPE MUTATEUR DES RALSTONIA/ALCALIGENES METALLOTOLERANTES Said TALBI(2,1), Yves MARKOWICZ (3), Safieh TAGHAVI.

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1 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE1 VITO LE PHENOTYPE MUTATEUR DES RALSTONIA/ALCALIGENES METALLOTOLERANTES Said TALBI(2,1), Yves MARKOWICZ (3), Safieh TAGHAVI (1), Hassan BRIM (2,1), Dirk SPRINGAEL(1), Daniel van der LELIE (1), Ariane TOUSSAINT (3,2), Max MERGEAY(1,2) (1)Milieutechnologie, VITO (Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek) Mol, Belgique (2)Laboratoire de Génétique des Procaryotes,ULB, Rhode-St-Genèse, Belgique (3) Laboratoire de Génétique Microbienne, Université Joseph Fourier, Grenoble, France

2 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE2 VITO Dans divers sols ou sédiments de biotopes industriels ou miniers (Congo, Belgique, Allemagne) fortement contaminés par les métaux lourds, lon peut trouver des bactéries porteuses des gènes czc, cnr ou ncc (résistances multiples aux métaux lourds) localisés sur de grands plasmides (180 à 300kb): une trentaine de ces souches ont été récemment assignées au moyen de techniques moléculaires au genre Ralstonia où elles forment un groupement susceptible de devenir sous peu une espèce distincte (Fig1). En attendant, elles portent la dénomination provisoire de Ralstonia eutropha-oïde.15 de ces souches sur 25 testées (Table1) à cet effet présentent un phénotype mutateur qui a surtout été étudié sur la souche CH34 et se révèle en particulier lorsque la souche est cultivée à 37°C (soit un degré avant dobserver une létalité complète). A cette température, seules à bactéries survivent. De 20 à 80% de ces survivants portent des mutations reconnaissables: les loci concernés (cartographiés pour la plupart) comprennent les gènes responsables de la synthèse de certains acides aminés (principalement la lysine : ce phénotype saccompagne dailleurs dune thermorésistance accrue et assez stable), de lautotrophie, de lutilisation de diverses sources de carbone et dazote. Les mutants multiples ne sont pas rares. Une classe importante des mutations observées sexprime par de profonds réarrangements des plasmides de résistance aux métaux lourds et fait intervenir des éléments transposables. Au vu de leffet de la température et dans le but de préciser la base génétique et moléculaire du phénomène, nous avons cherché à savoir 1°) si DnaK/Hsp70,leffecteur majeur de la réponse au choc thermique, joue un rôle. 2°) si le phénotype mutateur ne correspond quà un phénomène inductible à 37°C (notamment dans des cultures en milieu liquide) ou sil a une portée plus générale. INTRODUCTION

3 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE3 VITO -protéobactéries ; quelques nouvelles espèces à classifier. Phytopathogènes : R. solanacearum (ex-Pseudomonas, ex-Burkholderia) IVc. Chimiolithotrophes facultatif : H 2 +CO 2 : R. eutropha (ex-Alcaligenes eutrophus) I et II, HCOO - R. eutropha (ex-P. oxalaticus) I et II. Souches des biotopes pollués par les métaux lourds (naturellement ou par acivité anthrpogénique), I et IVa. Souches résistantes aux métaux lourds de la Nouvelle Calédonie (biotopes riches en nickel), III. Souches cataboliques qui dégradent le PCB, 2,4-D (ex-A. eutrophus) II et III. Isolats cliniques : R. pikettii, IVb. Le genre Ralstonia

4 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE4 VITO Métabolisme chimiolithotrophe. Présence de deux mégaplasmides pMOL28 et pMOL30 qui conférent les résistances aux métaux lourds. Capacité daccepter et dexprimer les gènes hétérologues. Phénomène décrit comme TSP : Thermospontagenèse Ralstonia eutropha CH34

5 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE5 VITO Mutagenèse et Mortalité Induite à la Température : TIMM Mortalité élevée à 37°C, à de survivants. Tsp est observé à 37 °C sur milieu riche seulement ou sur milieu minimum additioné de méthionine. 10 à 80% des survivants sont des mutants : Auxotrophies, source denergie, gènes cataboliques... Réarrangements plasmidiens : délétions, pertes, génération de pMOL50-like accompagné de la sensibilité aux métaux lourds. Les élements IS sont impliqués dans la Tsp(IS1086). Tsp est régulé par un locus chromosomique. Dautres stress comme la congélation et la coexistence des réplicons incompatibles induisent des mutations de type Tsp. Phénotype Tsp

6 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE6 VITO Distribution du phénotype Tsp parmi les souches Ralstonia métallorésistantes

7 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE7 VITO Arbre phylogénétique ARDRA

8 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE8 VITO I. Le gène dnaK de la souche CH34 («R.eutropha»/Alcaligenes ») et le phénotype mutateur Le gène dnaK a été cloné et séquencé ce qui nous a permis disoler un mutant qui nexprime plus ce gène. A 33°C, la croissance de ce mutant dnaK est ralentie mais son compte viable nest pas affecté ; le mutant ne pousse absolument plus à 35°C (Table 2). A 34°C, on observe la même mortalité quà 37°C pour le sauvage et avec un haut pourcentage de mutants parmi les survivants. Les phénotypes observés sont cependant différents : on nobserve pas de lys mais des auxotrophes pour le phosphate ou la sérine, types de mutants qui navaient jamais été observés jusquà présent. Mais aussi bien à 34°C chez le dnaK quà 37°C chez le sauvage on observe une fenêtre dun degré avant la létalité complète, qui permet la sélection de mutants. Il semble aussi que la mutation dnaK naffecte pas vraiment lefficacité du phénotype mutateur ni même son fonctionnement. Mutagenèse du gène dnaK

9 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE9 VITO Chinese hamster C. elegans D.melanogaster Pavlova lutherii Cryptomonas phi Ondotella sinensis Thermus aquaticus Halobacterium cutirubrum Halobacterium marismortui Agrobacterium tumefaciens Rhizobium meliloti Caulobacter crescentus Burkholderia cepacia E. coli Salmonella typhimurium Hemophilus ducreyi Hemophilus influenzae Francisella tularensis Chlamydia trachomatis Borrelia burgdorferi Bacillus megaterium Bacillus subtilis Lactococcus lactis Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Methanosarcina mazei Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Streptomyces coelicolor Clostridim acetobutylicum Hydra magnipapillata A. eutrophus CH34 Eucaryotes, animaux et végétaux Protéobactéries Bactéries à Gram + Ratus norvegicus Phylogénié basée sur la séquence de DnaK/HSP70

10 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE10 VITO U :amorce sens de pPw78 R :amorce antisens de pPw78 plac Tet oriColE1 oriT oriF pPw78::dnak TGA 2016 dnak23 pPw78dnak pPw78 R reverse 1200bp ATG 1 Gène dnaK chromosomique dnak22 Plasmide suicide pPW78 contenant un fragment du gène dnaK de 1227 bp. Recombinaison homologue et intégration dans le chromosome R U ~ = Tet ATG dnak18 promoteur Chromosome U universel 2016 Stratégie de mutagenèse

11 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE11 VITO a) le mutant dnaK10 a été obtenu par recombinaison homologue avec un plasmide Tet R contenant un fragment du gène dnaK de R. eutropha-like CH34. Les comptes viables d'AE2525 se font en présence de tétracycline. La fréquence de survie 1 correspond à un compte viable de 5 x 10 8 ; 0 = une fréquence inférieure ou égale à 2 x ) (b) Croissance ralentie (c) Parmi 150 survivants à 34°C testés pour la présence de mutations : les phénotypes suivants ont été retrouvés : 7 Aut -, 9 Pho - (auxotrophes pour le phosphate), 1 Aut - Pho -, 1 Ser et 1 Pro - (d) Après 5 jours d'incubation, quelques colonies apparaissent (suppresseurs ?). Réponse à la température du mutant dnaK -

12 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE12 VITO Les résultats rapportés (comptes viables et production de mutants dans 80 cultures (40 cultivées à 29° et 40 cultivées à 37°C) suggère que maintes mutations préexistent à 29°C et que le phénotype mutateur existe aussi à cette température. Mais apparemment seule lexposition prolongée à 37°C permet de sélectionner certains phénotypes thermorésistants comme celui qui accompagne lauxotrophie pour la lysine mais lévénement, qui cause cette mutation, semble pouvoir être généré aux deux températures. Par ailleurs, ces mutants lys - dont le compte viable sur boîtes est à peine affecté à 37°C affecté à continuent de muter à 37°C : ceci est observé aussi bien milieu liquide que sur boîtes :on peut donc apparemment séparer leffet de mortalité de la mutagenèse et donc maintenir celle-ci à un niveau extrêmement élevé par rapport au compte viable. Cette observation pourrait trouver une application dans la mutagenèse dirigée (extension du spectre de dégradation de certaines familles de substrats récalcitrants). Approches du phénotype mutateur en cultures liquides

13 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE13 VITO

14 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE14 VITO Une préculture en milieu minimal en fin de phase log. a été inoculée dans à 400mL de milieu LB ( cell/mL) divisés en 80fractions de 5 mL incubées dans des tubes à essai: 40 à 29°C et 40 à 37°C. A la fin des temps indiqués, les cultures sont titrées aux deux températures et les comptes viables sont testés par répliques pour la présence de mutants. Les résultats des répliques présentés ici concernent une seule culture caractéristique ou significative. a)&c) Les cultures à 29°C ont un titre moyen de ufc/mL; leurs comptes viables ont une survie moyenne de (a) et 3, (c). b)les cultures à 37°C sont quasi limpides ; titre moyen à 29°:1,1.10 3, à 37°: 13 ufc/mL. c) sur les 40 cultures à 29°C, seules 9 fournissent quelques mutants pour leffectif testé (100 colonies): lexemple montré indique la limite supérieure d)sur les 40 cultures à 37°C, 5 ne contenaient que des prototrophes (en fait des mutants thermorésistants), 1 que des Lys -, 1 que des Aut -, 11 étaient entierement mutantes avec une fraction de mutants doubles et multiples, 22 contenaient un mélange de mutants et de prototrophes. Cultures en milieu liquide et production de mutants

15 DIENST INFORMATIESYSTEMENFILE15 VITO Ces observations induisent de nombreuses questions parmi lesquelles : - la température na-t-elle quun effet de sélection de certains phénotypes ou doit-on considérer quelle puisse aussi induire certains événements (remarquons à cet égard, que dautres stress (comme la coexistence forcée entre deux réplicons incompatibles) génèrent dans la souche CH34 de hautes fréquences de mutants producteurs de mélanine (tyu - ) ) ? - le phénotype mutateur (qui apparaît ici comme un caractère taxinomique) est-il vraiment lié à la survie dans des biotopes hostiles ? ; et dans ce cas, est-il une illustration dun système vivant où une réparation de type SOS serait «surexprimée » pour garantir ladaptation évolutive dans un environnement hostile à défaut dune survie adéquate ? - les mutations qui sont générées par ce phénotype mutateur offrent-elles un avantage quelconque à la bactérie ? Peut-on utiliser ce phénotype pour une sélection de type «positif» ? - comment sont générées les mutations multiples comme celles que lon observe dans les remaniements plasmidiens ? CONCLUSION


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