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CHARME1 Thème : Thème : Culture et production de cellules phytoplanctoniques. Réponses du phytoplancton aux ajouts de contaminants métalliques. Caractérisation.

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1 CHARME1 Thème : Thème : Culture et production de cellules phytoplanctoniques. Réponses du phytoplancton aux ajouts de contaminants métalliques. Caractérisation structurale des exsudats Orateur: MARZOUKI Mohamed -Laboratoire daccueil : PROTEE-CAPTE (Toulon) – Maître de stage : M. C. Le Poupon Mme. Ortalo-Magne Annick, 12 juin 2006

2 CHARME2 Carbone organique extracellulaire (exsudat) 1.Cultiver et produire des cellules de diatomées 2. Isoler et caractériser leurs polymères but Amélioration de la connaissance des phénomènes chimiques dans lenvironnement côtier

3 CHARME3 Intérêt de travail importance écologique : source dénergie causer des changements sur lécosystème Carbone organique extracellulaire (exsudat)

4 CHARME4 Analyse des données bibliographiques Secteur détude La petite rade de Toulon - grande activité humaine - industrie chimique - port commercial et militaire Apport conséquent en Contaminants variés

5 CHARME5 La connaissance de trois termes suivants: - Phytoplancton - Polysaccharide - cuivre Analyse des données bibliographiques Phytoplancton croit prés de la surface première chaîne alimentaire la production de la matière organique(MO) équivalent à lensemble de la végétation terrestre puis de CO 2 peut avoir une grande influence sur le climat par léchange de CO 2 Lumière pour la photosynthèse

6 CHARME6 Analyse des données bibliographiques Polysaccharides - les plus abondants dans les océans - présentent une grande surface active permettant de jouer un rôle dans la fixation des polluants métalliques il y a deux types de polysaccharides - polysaccharides de réserve: source dénergie - polysaccharides structuraux [Cx(H2O)y)]n- (où y est généralement x – 1) Cuivre - le plus complexé par la MO - on le trouve partout dans lenvironnement - Facile à analyser

7 CHARME7 1.Cultiver et produire des cellules de diatomées Méthodologies Souche naturelle de diatomée cylindrotheca Closterium - Prélèvement: rade de Toulon - Concentrer par filtration inverse - Isolation par dilutions successives - Repartir entre différents erlen-meyer Dans un milieu f/2: f/2: Solution de sels nutritifs Solution métallique Solution vitaminique

8 CHARME8 Méthodologies Le développement des cultures se fait : - Chambre thermostaté 17°C - Éclairement contenu Éclairement contenu plus dexsudation

9 CHARME9 Méthodologies Les Conditions optimales de la culture Travail précédent M2 a permit dobtenir les résultats suivants: 1- la croissance algale se fait selon 3 phases Phase exponentielle Phase stationnairePhase de latence

10 CHARME10 Méthodologies 2- la production de polysaccharides est maximale à la phase stationnaire Pour obtenir le maximum dexsudation Travail dans les mêmes conditions - dans une chambre thermostatée 17°C - Éclairement contenu - larrêt de la culture à la phase stationnaire - Double densité cellulaire - Augmentation de volume 4 fois On a ajouté Phase stationnaire

11 CHARME11 Méthodologies Suivre la croissance et lexcrétion phytoplanctonique - Létape de la croissance - Concentration du carbone organique totale 1- Suivre la croissance - Comptage - Concentration en chlorophylle-a Microscope Fluorescence 2- Suivre lexcrétion dexsudats - concentration de COD - concentration de glucose analyseur TOC Spectroscopie UV-visible analyseur TOC

12 CHARME12 Méthodologies Culture en phase stationnaire (7 jours) Arrêt de la culture par filtration (0,45 µm) Séchage Extraction avec NaCl 1,5 M + Agitation Centrifugation 30/4°C Filtration 0, 45µm Filtrat surnageant Ultrafiltration, (dialyse concentration) 1kDa Rotavapor Partage CHCl 3 /MeOH/H 2 O Phase aqueusePhase Organique Ethnol. (4fois V)/4°C/1 nuit EPS liée Centrifugation 30/4°C EPS libre Isolement

13 CHARME13 Caractérisation structurale des exsudats Méthodologie 1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 3- Voltampérométrie à redissolution anodique (DPASV). 4- Spectre Infra Rouge IR 1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) - mettre en évidence lexistence des polysaccharides - la différence de structure entre les deux phases, particulaire et dissoute - la différence entre les deux milieux (sain et pollué) 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) - déterminer les compositions monosaccharidiques - taux de glucides 3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV). - ladaptation des cellules aux deux concentrations dun polluant métallique - envisager le déroulement des mécanismes de détoxification 4- Spectre Infra Rouge IR voir les groupements fonctionnels qui peuvent complexer le cuivre

14 CHARME14 1- Culture et production de cellules phytoplanctoniques. ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Témoin 0 Cu3 erlen-meyer x 1L 500 ppb Cu3 erlen-meyer x 1L 1000 ppb Cu3 erlen-meyer x 1L Phase exponentielle Phase stationnaire Phase latence 3 jours

15 CHARME15 Deuxième culture Troisième culture ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES - Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente pour les trois cultures réalisées? - Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente par rapport aux recherches précédentes pour des espèces voisines ? - Pourquoi y a t-il une chute de COD dans la première culture ? - Quelle transformation a subi le COD dans la première culture ?

16 CHARME16 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES On considérer quil y a - Une culture homogène - Une seule espèce en réalité - Culture hétérogène - Il y a dautres micro-organismes (bactérie…….) Pour avoir une bonne culture il faut: - Sélection par prélèvement contenu 4, 5 fois - élimination des autres espèces (bactérie) - Ajuster les facteurs influencent la culture (lumière, température,….) La disparition de COD dans la première culture: - Consommation bactérienne - Précipitation

17 CHARME17 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Isolement masse polysaccharide ppb Cuivr eEPS libreEPS liée la première culture (7 jours) Témoin6,055,6 5008,028, ,91,84 la deuxième culture (11 jours 1 /2) Témoin1– 5002,15– 10001,55– La quantité augmente avec la [ ] de cuivre ppb Cu: utilisation de polysacch pour la détoxification ppb Cu: non adaptation au milieu, mortalité La quantité de polysaccharides dans la phase dissoute est plus important que sur les cellules Dans la phase stationnaire la quantité de polysacch est plus importante

18 CHARME18 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Spectre H-RMN 0 ppb Cu PES Liée 0 ppb Cu PES Libre Il na y pas nécessité de se protégerla quantité des EPS faibles

19 CHARME ppb Cu PES Libre 1- Spectre H-RMN ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 500 ppb Cu PES Liée Différence - lintensité - lenvironnement moléculaire Existence des EPS

20 CHARME20 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). ArabinoseRahmanoseManoseXyloseGalactoseGlucose αQPαQPαQPαQPαQPαQP 01,060,033,411,120,49501,120,1111,21,10,11111,10,12121,10,15,54 ESP Libres5001,06--1,120,74741,10,0771,10,15151,10,2351,10, ,060,099,111,120,49501,10,1414,91,10,34341,10,35351,10, ,13--1,12--1, ESP Liés ,120,42421,10,0661,10,0441,10,13131,10, ,06--1,120,881,120,0331,10,08810,0221,103 α = temps de rétention Q = la quantité de chaque monosaccharide en µL R%= le pourcentage de chaque monosaccharide - = traces monosaccharides non quantifiés Identification des 6 monosaccharides (/ références) pour les 6 EPS La même origine

21 CHARME21 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 30,031,1220,021,0480,081, ,111,12130,131,0540,041,09500ESP Liés --1,12--1,05--1, ,151,12350,351,0534,40,341, ,11,11350,21,05150,151,09500ESP Libres 5,540,051,12120,121,0511,30,111,110 P %Qα Qα Qα xyloseGalactoseGlucose 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). La pourcentage augmente en milieu contaminé EPS Liés renouvellement EPS Libres Accumulation

22 CHARME22 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV). Nous continuons encore à ajuster notre protocole - les ESP ont une grande capacité complexante - les ESP en milieu contaminé est plus complexant [ ] Cu = 1000µM [ ] ESP = 1mg/l

23 CHARME23 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 4 Infra rouge (IR) 1- sur les cellules 500 Témoin 1000 Superposition des bandes + déplacement de certaines fréquence du fait de leur environnement structurale = Distinction nette est très difficile des bandes 1000 Témoin 500 déconvolution Cu 500 ppb Témoin Cu 1000 ppb

24 CHARME24 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Associés à des liaison de compléxation M-O (O acide carboxylique) Cu 1000 ppb Témoin Cu 500 ppb déconvolution Les fonctions structurales sont associées au métal 4 Infra rouge (IR) 1- Des cellules

25 CHARME25 4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 0 ppbCu500 ppbCu 1000 ppbCu Absorption plus important quand la [ ] Cu augmente Attribuée à lutilisation des fonctions organiques dans Les liaisons M-O/O-M-O Sont moins intenses Attribué à laugmentation de la contribution des Bandes de vibration Métal-N

26 CHARME26 0 ppbCu500 ppbCu 1000 ppbCu 4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Illustre bien la mobilisation des ses groupes fonctionnels avec le Métal quasi-absent Existence da lacide uronique Absence des signaux de CH2 et CH3(2924,2854) principalement composé dacide uronique

27 CHARME27 Conclusions et perspectives Ce stage nous a permit: - La sélection des individus qui ont les mêmes caractéristiques - Traitement spécial pour éliminer tous micro-organismes culture homogène - amélioration des connaissances des cultures - confirmation de certains résultats sur lexsudation - caractérisation structurale des polysaccharides - Le développement cellulaire est affecté par la contamination métallique - Lexsudation est dautant plus importante que le milieu est contaminé La présence des différentes composés Le pourcentage relatif de certains croit avec la [ ] en Cu La contamination augmente les sites complexants jouer un rôle considérable dans le mécanisme de détoxification perspectives - Orientation vers une caractérisation fine des exsudats - Travail multiparamètrés sur différentes espèces phytoplanctoniques et contamination par plusieurs métaux lourds

28 CHARME 28 Merci pour votre attention


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