Voies de signalisation impliquées dans le contrôle

Voies de signalisation impliquées dans le contrôle
de la prolifération et de la différenciation cellulaires Introduction Générale Mécanismes de Contrôle du Cycle Cellulaire Déterminants Moléculaires de la Différenciation Cellulaire Introduction Etude des mécanismes de différenciation : démarche expérimentale III. Contrôle génétique et épigénétique de la différenciation IV. Rôle du microenvironnement dans le contrôle de la différenciation Analyse de trois modèles de différenciation Quelques exemples du rôle du cytosquelette dans la différenciation cellulaire

Déterminants Moléculaires de la Différenciation Cellulaire
Chaque type cellulaire se caractérise par un profil particulier d’expression des gènes

Cell type Differentiated cell product Specialized function of cell Keratinocyte (epidermal cell) Keratin Protection against abrasion, desiccation Erythrocyte (red blood cell) Hemoglobin Transport of oxygen Lens cell Crystallins Transmission of light B lymphocyte Immunoglobulins Antibody synthesis T lymphocyte Cell-surface antigens (lymphokines) Destruction of foreign cells; regulation of immune response Melanocyte Melanin Pigment production Pancreatic islet cells Insulin Regulation of carbohydrate metabolism Leydig cell (♂) Testosterone Male sexual characteristics Chondrocyte (cartilage cell) Chondroitin sulfate; type II collagen Tendons and ligaments Osteoblast (bone-forming cell) Bone matrix Skeletal support Myocyte (muscle cell) Muscle actin and myosin Contraction Hepatocyte (liver cell) Serum albumin; numerous enzymes Production of serum proteins and numerous enzymatic functions Neurons Neurotransmitters (acetylcholine epinephrine, etc.) Transmission of electrical impulses Tubule cell (♀) of hen oviduct Ovalbumin Egg white proteins for nutrition and protection of embryo Follicle cell (♀) of insect ovary Chorion proteins Eggshell proteins for protection of embryo Quelques exemples de cellules différenciées :

Chaque type cellulaire se caractérise par un profil particulier d’expression des gènes ... comment ces gènes sont-ils sélectionnés ? altérations structurales du matériel génétique ? pas d’altérations structurales, mais contrôle de l’expression par des protéines régulatrices ?

Chaque type cellulaire se caractérise par un profil particulier d’expression des gènes ... comment ces gènes sont-ils sélectionnés ? altérations structurales du matériel génétique ? pas d’altérations structurales, mais contrôle de l’expression par des protéines régulatrices

Expérience de fusion cellulaire :
 l’expression des gènes est réversible  les protéines présentes dans le cytoplasme des cellules musculaires de rat ont modifié le profil d’expression des gènes dans le noyau de la cellule hépatique différenciée humaine  les protéines qui contrôlent la transcription des gènes exprimés dans les cellules musculaires sont très conservés

Les grandes étapes de la différenciation :
Précurseur / Progéniteur multipotent

Précurseur / Progéniteur multipotent restriction progressive de la plasticité et donc du potentiel de différenciation Précurseur « spécifié » « Engagement » l’engagement n’est pas encore irréversible Cellule « déterminée » l’engagement est irréversible

Précurseur / Progéniteur multipotent restriction progressive de la plasticité et donc du potentiel de différenciation Précurseur « spécifié » « Engagement » Cellule « déterminée » (=expression de combinaisons particulières de facteurs de transcription) Différenciation terminale expression de gènes de fonction = gènes « marqueurs », caractéristiques du phénotype cellulaire

Précurseur / Progéniteur multipotent restriction progressive de la plasticité et donc du potentiel de différenciation Précurseur « spécifié » « Engagement » Cellule « déterminée » (=expression de combinaisons particulières de facteurs de transcription ...mais aussi : - de récepteurs membranaires - de protéines cytoplasmiques ) Différenciation terminale expression de gènes de fonction = gènes « marqueurs », caractéristiques du phénotype cellulaire

Pourquoi les cellules n’expriment-elles pas tous leurs gènes ?
 Comment s’opère la sélection ?  Quand débute-t-elle ?

Expériences menées sur des ovocytes de Xénope :
après fécondation  rotation corticale Pôle « animal » (pigmenté) Pôle « végétatif »  après seulement quelques divisions, les cellules de l’oeuf ne possèdent déjà plus les mêmes potentialités

Lors des divisions, les deux cellules filles héritent du même patrimoine génétique . . .
. . . en revanche, les ARNm et protéines maternels sont répartis de façon asymétrique dans l’ovocyte et dans la cellule oeuf après fécondation  lors des divisions, ces molécules ne seront pas distribuées de manière équitable entre les deux cellules filles

Pour certaine cellules, l’état différencié n’est pas stable
1er exemple : dédifférenciation lors de la régénération des membres chez le Triton après amputation, les cellules situées sous l’épiderme de cicatrisation perdent leur caractère spécialisé = elles se « dédifférencient » ensuite, elles se divisent puis se différencient en : -cartilage -muscle -tissu conjonctif

Pour certaine cellules, l’état différencié n’est pas stable
2ème exemple : transdifférenciation de l’épithélium pigmentaire rétinien Épithélium pigmentaire (présence de grains de mélanine = coloration noire) Neuroépithélium rétinien

Les cellules épithéliales se sont « transdifférenciées » en neurones
Pour certaine cellules, l’état différencié n’est pas stable 2ème exemple : transdifférenciation de l’épithélium pigmentaire rétinien Explant d’épithélium pigmenté, cultivé en présence de FGF basique : Observation d’une coupe de l’explant au microscope photonique (lumière blanche) RPE = retinal pigmented epithelium Immunodétection d’un marqueur neuronal (observation au microscope à fluorescence) dépigmentation expression de marqueurs neuronaux Les cellules épithéliales se sont « transdifférenciées » en neurones

Etude des mécanismes de différenciation : démarche expérimentale
QUOI ? - Quelles sont les caractéristiques fonctionnelles de ces cellules ? -morphologie ? -expression de protéines spécifiques ? -propriétés particulières ? OU ? - Dans quels organes, tissus ou structures trouve-t-on ces cellules ? - Quelle est l’origine embryologique de ces cellules ? (quel feuillet embryonnaire ?) QUAND ? - A quel stade du développement embryonnaire ces cellules apparaissent-elles ? -à quel stade les précurseurs sortent-ils de mitose ? -à quel stade apparaissent les premières cellules différenciées ? (critères morphologiques ; expression des gènes de fonction) -les gènes de fonction de ces cellules s’expriment-ils tous en même temps ou bien sont-ils activés de manière séquentielle ?

COMMENT ? - Quelle est l’influence du microenvironnement sur la différenciation de ces cellules ? - si les précurseurs sont isolés en culture dans un milieu « neutre », sont-ils capables de poursuivre leur programme de différenciation de manière autonome ?  si oui, à partir de quel stade acquièrent-ils cette capacité ?  si non, par quels types de signaux externes leur différenciation est-elle influencée ? - les précurseurs se déterminent-ils avant ou après leur dernière mitose ? - Quelles sont les molécules présentes dans le microenvironnement ?  au moment où les précurseurs entament leur spécification ?  au moment de la différenciation terminale ? Ces molécules sont-elles capables d’influencer le devenir des précurseurs ? In vivo ? In vitro ?

COMMENT ? - Quels facteurs transcriptionnels ces cellules expriment-elles ?  lorsqu’elles entament leur spécification ?  lorqu’elles deviennent déterminées ?  lorsqu’elles effectuent leur différenciation terminale ?  lorsqu’elles ont achevé leur différenciation ? Ces facteurs transcriptionnels sont-ils nécessaires, indispensables et/ou suffisant pour induire la différenciation ? A quelles étapes interviennent-ils ? Quelles sont leurs cibles ?

facteurs généraux de transcription
Contrôle Génétique de la Différenciation : Facteur Transcriptionnel : = protéine nucléaire qui possède : - un (ou plusieurs) domaine(s) lui permettant de reconnaître très spécifiquement une séquence d’ADN et de se lier avec une forte affinité à cette séquence le facteur protéique agit en « trans » (se lie dans la région régulatrice d’un gène, qui n’est pas nécessairement le sien) = c’est un facteur de transcription la séquence agit en « cis » (elle contrôle l’expression du gène dont elle fait partie) = c’est une séquence cis-régulatrice facteurs généraux de transcription ARN transcrit promoteur amplificateur

facteurs généraux de transcription
Contrôle Génétique de la Différenciation : Facteur Transcriptionnel : = protéine nucléaire qui possède : - un (ou plusieurs) domaine(s) lui permettant de reconnaître très spécifiquement une séquence d’ADN et de se lier avec une forte affinité à cette séquence - un domaine lui permettant d’activer ou de réprimer la trancription par l’ARN polymérase II - un domaine lui permettant d’interagir avec d’autres facteurs (formation d’homodimères ou d’hétérodimères) facteurs généraux de transcription ARN transcrit promoteur amplificateur

Contrôle Génétique de la Différenciation :
Les interactions entre facteurs transcriptionnels peuvent avoir des effets : A B A+B additifs synergiques A B A+B A B A+B antagonistes La différenciation d’un type cellulaire donné repose sur l’action coordonnée d’une combinaison de facteurs transcriptionnels

Contrôle Epigénétique de la Différenciation :
Structure de la chromatine :

Structure de la chromatine et contrôle de la transcription : Les extrémités N-terminales des histones s’étendent vers l’extérieur des nucléosomes ... ...leur acétylation réduit l’affinité des histones pour l’ADN et relâche donc la structure de la chromatine.

Structure de la chromatine et contrôle de la transcription : Les facteurs transcriptionnels activateurs agissent très souvent en recrutant des « Coactivateurs » (complexes protéiques contenant des HATs = histones-acétyltransférases) Les facteurs transcriptionnels répresseurs agissent très souvent en recrutant des « Corépresseurs » (complexes protéiques contenant des HDACs = histones-désacétylases)

La transcription des gènes peut être réprimée de différentes façons :

Remodelage de la chromatine au cours de la différenciation : Mise en évidence par digestion à l’ADNase I : exemple du gène de la -globine HS : hypersensitive site EtBr : bromure d’éthidium

Remodelage de la chromatine au cours de la différenciation : « hétérochromatine » et « euchromatine »

Remodelage de la chromatine au cours de la différenciation :  marquage du gène Mash1 par hybridation in situ avec une sonde d’ADN fluorescente cellules souches embryonnaires neurone différencié Lors de la différenciation neuronale, on observe une tranlocation du gène Mash1 de la périphérie vers le centre du noyau

Les régions d’ADN riches en guanines et cytosines (=« ilôts CpG ») peuvent être méthylées au niveau des cytosines  les régions hyperméthylées lient préférentiellement des « HDACs » (et ne sont donc pas transcrites)  les régions hypométhylées lient préférentiellement des « HATs » (et sont donc transcrites)

. . . en conclusion . . . La différenciation d’un type cellulaire donné repose sur : 1) L’expression de la combinaison adéquate de facteurs transcriptionnels - activateurs et répresseurs 2) « L’ouverture » de la chromatine au niveau de certains gènes 3) L’ hypométhylation des gènes que la cellule doit exprimer et l’hyperméthylation des gènes que la cellule ne doit pas, ou n’a pas besoin, d’exprimer

Méthodes d’identification des facteurs impliqués dans la différenciation
- Recherche d’individus présentant des anomalies visibles au cours du développement  les facteurs transcriptionnels qui contrôlent l’organogenèse jouent parfois un rôle spécifique dans la différenciation cellulaire, à des stades plus tardifs du développement exemple : Otx2 (facteur transcriptionnel à homéodomaine) -souris Otx2-/- : non-viables (pas de tête) -souris Otx2+/- : anophtalmie, microphtalmie, absence de cristallin, de cornée ou d’iris (selon les individus) - inactivation tardive Otx2-/- : absence de photorécepteurs - Recherche des orthologues de gènes d’invertébrés exemple : Otd chez la drosophile -Otd-/- : pas de structures antérieures -Otd+/- : défaut de formation des photorécepteurs …Otx2 est l’un des orthologues d’Otd

Si les mutations d’un gène provoquent des anomalies notables dans le développement de l’embryon :
 où et quand ce gène est-il exprimé ?  son expression se restreint-elle à une région, un organe ou un type cellulaire particulier ?

Méthodes d’identification des facteurs impliqués dans la différenciation
- Purification ou clonage de facteurs transcriptionnels susceptibles d’activer les gènes de fonction -Cloner les régions régulatrices de la transcription des gènes de fonction -Localiser les éléments cis-régulateurs indispensables pour activer la transcription :

La séquence de 20 pb délétée contient un élément cis-régulateur important.
Cet élément cis-régulateur peut être utilisé comme « appât » pour purifier ou cloner le facteur transcriptionnel liant cette séquence

Evaluation du rôle des facteurs identifiés :
- Structure du facteur ? si obtenu par purification ou clonage Analyse de la séquence d’acides aminés et détermination de la structure (domaine de liaison à l’ADN, doigt de zinc, hélice-boucle-hélice …) - Dans quel tissu est-il exprimé ? - Dans quels types cellulaires ? - Est-il capable d’activer la transcription des gènes de fonction ?

- Est-il capable d’activer la transcription des gènes de fonction ? Transfection dans des cellules hôtes qui n’expriment pas le gène de fonction, ni le facteur transcriptionnel identifié (ni la luciférase) les cellules transfectées ne peuvent pas activer la région régulatrice du gène de fonction (car elles n’expriment pas les facteurs transcriptionnels adéquats)  pas d’expression de la luciférase

- Est-il capable d’activer la transcription des gènes de fonction ? Transfection dans des cellules hôtes qui n’expriment pas le gène de fonction, ni le facteur transcriptionnel identifié (ni la luciférase) les cellules transfectées vont se mettre à exprimer le nouveau facteur transcriptionnel

- Est-il capable d’activer la transcription des gènes de fonction ? Cotransfection dans des cellules hôtes qui n’expriment pas le gène de fonction, ni le facteur transcriptionnel identifié (ni la luciférase) si le facteur transcriptionnel n’est pas capable de lier le promoteur du gène de fonction  pas de transcription  pas d’expression de la luciférase

- Est-il capable d’activer la transcription des gènes de fonction ? Cotransfection dans des cellules hôtes qui n’expriment pas le gène de fonction, ni le facteur transcriptionnel identifié (ni la luciférase) si le facteur transcriptionnel est capable de lier le promoteur du gène de fonction  transcription  expression de la luciférase

- Quel rôle ce facteur joue-t-il vraiment in vivo ?  Inactivation du gène : - chez poisson-zèbre ou xénope : utilisation d’ARN antisens - chez souris : production de « knockout » - les mutants homozygotes ne sont pas viables : analyser les hétérozygotes - les mutants hétérozygotes présentent des anomalies visibles :  approfondir l’analyse à l’échelle cellulaire - ni les homozygotes ni les hétérozygotes ne présentent d’anomalie visible :  procéder quand même à l’analyse à l’échelle cellulaire

- Quel rôle ce facteur joue-t-il vraiment in vivo ?  Surexpression du gène : - chez xénope : injection d’ARN - chez souris : injection de plasmide (région codante du facteur, sous contrôle d’un promoteur viral ...) - dans le site naturel :  le facteur est-il capable d’augmenter le nombre de précurseurs s’orientant vers la voie de différenciation étudiée ? - dans un site ectopique :  le facteur est-il capable d’induire la différenciation du type cellulaire étudié, dans un site où ces cellules ne sont normalement pas rencontrées ? (...est-il capable d’imposer ce phénotype à des cellules dont ce n’était pas le destin ?)

Rôle du microenvironnement dans le contrôle de la différenciation
Dès les 1ères divisions de l’oeuf, certains ARNm et protéines maternels sont répartis de façon asymétrique entre les cellules filles . . . . . . certaines de ces protéines maternelles (et protéines codées par les ARNm maternels) vont influencer l’expression des gènes dans les cellules voisines . . . . . . cette expression différentielle des gènes va entraîner la libération de nouvelles molécules dans le milieu extracellulaire . . . . . . l’environnement va ainsi progressivement se modifier

Dans les 1ères étapes du developpement, les signaux libérés vont contribuer à la mise en place des axes embryonnaires . . . . . . à des stades plus avancés, certains de ces signaux pourront être réutilisés pour orienter progressivement la différenciation des précurseurs vers un phénotype particulier Trois grands types de signaux sont impliqués dans le contrôle de la différenciation : - signaux diffusibles - interactions cellule-cellule - interactions cellule-matrice extracellulaire

Ces signaux de l’environnement influencent : - la prolifération (sortie de mitose) - le choix de différenciation les mouvements (certaines cellules se différencient à distance de leur site « de naissance » : migration) - la morphologie (mise en place d’une polarité) - l’organisation des cellules au sein des tissus - la survie - le maintien de l’état différencié

Ces signaux de l’environnement agissent sur les cellules : - en modifiant leur profil d’expression des gènes - en induisant un remodelage de leur cytosquelette

Ces signaux de l’environnement agissent sur les cellules : - en modifiant leur profil d’expression des gènes - en induisant un remodelage de leur cytosquelette - modification de la longueur des filaments du cytosquelette - modification de la localisation des filaments du cytosquelette - modification de l’organisation spatiale des filaments du cytosquelette

Les 3 Principaux éléments du cytosquelette :

Remodelage du cytosquelette : activation des petites protéines G
Rho, Rac et Cdc42

Rho, Rac et Cdc42 GTP GDP inactive active GEF (guanine nucleotide exchange factor) GAP (GTPase activating protein) Pi

Rho, Rac et Cdc42 fibroblastes cultivés en milieu sans sérum fibres de stress lamellipodes filopodes

Interactions Cellule-Cellule Les Cadhérines

E-cadhérine N-cadhérine E-cadhérine N-cadhérine cadhérine-7
Importance des interactions cellule-cellule dans la différenciation : exemple de la migration des cellules des crêtes neurales N-cadhérine E-cadhérine N-cadhérine E-cadhérine cadhérine-7 N-cadhérine

Interactions Cellule-Cellule Les Cadhérines

Interactions Cellule-Cellule Les Cadhérines modulation de l’activité des petites protéine G Rho, Rac et Cdc42 ancrage des microfilaments d’actine, à la membrane interaction avec d’autres récepteurs transmembra- -naires (exple : RTK...)

Interactions Cellule-Cellule N-CAM neural cell-adhesion molecule  Superfamille des immunoglobulines  Interactions cellule-cellule indépendantes du Ca2+  Interactions homophiles  plus de 20 isoformes (épissage alternatif)  exprimées dans le système nerveux, mais aussi dans de nombreux autres types cellulaires  Souris N-CAM -/- sont viables mais présentent des anomalies de développement du cerveau

Interactions Cellule-Cellule Delta et Notch

Interactions Cellule-Matrice La matrice extracellulaire est composée de : - chaînes de polysaccharides (= glycosaminoglycannes, GAGs), généralement sous forme de protéoglycannes (liés à des protéines) - protéines fibreuses : collagène, élastine, fibronectine, laminine ... Cette matrice est produite et sécrétée par : - les fibroblastes - les chondrocytes (matrice cartilagineuse) - les ostéocytes (matrice osseuse)

Interactions Cellule-Matrice CD44 = récepteur de l’acide hyaluronique (GAG) répétition de fois du motif disaccharide n’est pas lié à des protéines est particulièrement abondant pendant l’embryogenèse

Interactions Cellule-Matrice CD44 = récepteur de l’acide hyaluronique ERM = Ezrin, Radixin, Moesin ; PIP2 = phosphatidyl-inositol biphosphate

Interactions Cellule-Matrice Les intégrines - 2 sous-unités :  et  - lient les protéines de la matrice: fibronectine, laminine, collagène ... - interactions dépendantes d’ions bivalents (Ca2+ ou Mg2+) - domaine intracellulaire relié au cytosquelette d’actine, par l’intermédiaire de diverses protéines (taline, vinculine ...etc) - principale voie de transduction : activation de la FAK (focal adhesion kinase)

Signalisation par des facteurs diffusibles - Les molécules de signalisation libérées dans le milieu extracellulaire se répartissent généralement en gradients ... ... en fonction de la distance qui les séparent du site de production de la molécule, les cellules seront exposées à des concentrations plus ou moins élevées. alternativement :

Signalisation par des facteurs diffusibles Les cellules de l’embryon se trouvent exposées à différentes combinaisons de signaux Ces combinaisons varient en fonction de la position qu’elles occupent dans l’embryon, ou même au sein d’un tissu particulier ( contrôle spatial de la différenciation) Le microenvironnement évolue au cours du temps ( contrôle temporel de la différenciation)

Signalisation par des facteurs diffusibles Signaux ? facteurs protéiques facteurs non protéiques

Signalisation par des récepteurs transmembranaires
- « facteurs de croissance » (action sur RTK) - Facteurs de la superfamille du TGF - Wnt - Hedgehog

- « facteurs de croissance » (action sur RTK)

 formation de multimères de FGF
Récepteurs des FGFs Association du FGF avec des protéoglycanes à héparan sulfate de la membrane ou de la matrice protéoglycanes = protéines associées à de longues chaînes composées d’unités répétées de disaccharides héparan sulfate = polymère de (GlcNac trisulfate – acide iduronique)  formation de multimères de FGF  dimérisation des récepteurs du FGF

 dimérisation du récepteur
 autophosphorylation sur des résidus tyrosine  recrutement de diverses protéines cytosoliques (exple : Src)  activation de cascades de phosphorylation (exple : activation de petites protéines G type Ras, Rho ...etc)  activation de facteurs transcriptionnels  modification de l’expresssion des gènes  remodelage du cytosquelette

- Superfamille du Transforming Growth Factor beta (TGF)

- Wnt (homologue du facteur wingless de Drosophile)

- Hedgehog

Signalisation par des facteurs diffusibles facteurs non protéiques  Signalisation par des récepteurs nucléaires

Signalisation par des récepteurs nucléaires
1) Formation du complexe Ligand-Récepteur dans le cytoplasme  dissociation du récepteur et d’une protéine inhibitrice  migration du récepteur dans le noyau  liaison du complexe ligand-récepteur à l’ADN  activation ou répression de la transcription du gène 2) Formation du complexe Ligand-Récepteur dans le noyau (le récepteur est déjà lié à l’ADN, mais est inactif)  activation du récepteur/facteur transcriptionnel  activation ou répression de la transcription du gène

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