Étude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiques

Étude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiques
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1- Antibiotiques : généralités
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1-1- Définition dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

L’antibiothérapie Découverte… Staphylococcus aureus Penicillium dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Découverte (antibiothérapie) Staphylococcus aureus Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures. Un jour il ensemence une boîte avec du S. aureus et oublie la boite sur la paillasse. Quelques jours plus tard, il constate l’apparition d’un champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone d’inhibition autour du Staphylococcus. Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Penicillium

Distinguer Antibiotiques et Antiseptiques Les antiseptiques (comme l'eau de Javel) sont des molécules - toxiques pour les microorganismes, - aussi toxiques pour les cellules eucaryotes - toxiques à des doses importantes (de l'ordre du g ou du mg cm-3). Au contraire les antibiotiques sont : - des molécules toxiques pour certains microorganismes et non pour d'autres, ce qui signe une spécificité d'action absente chez les antiseptiques. - des molécules peu toxiques pour les cellules animales - des molécules toxiques pour leurs cibles à des concentrations faibles (de l'ordre du µg cm-3) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Définition… (antibiothérapie)
Un antibiotique est une molécule toxique (statique ou cide) pour un groupe cible de microorganismes (bactéries, champignons, virus, parasites eucaryotes …) de mode d'action spécifique active à des concentrations faibles de l'ordre du µg.cm-3 généralement synthétisé par un microorganisme mais souvent modifié chimiquement ou même synthétisé entièrement par les Chimistes. peu toxique pour les cellules eucaryotes supérieures en pratique donc utilisables par voie générale. Existent des antibiotiques anti-fongiques, anti-bactériens, et à la limite anti-parasites. Des antibiotiques anti-bactériens comme le métronidazole ou les sulfamides qui sont aussi actifs sur certains parasites eucaryotes … ce qui justifie une définition large du terme antibiotique ! Des antibiotiques toxiques existent mais ne sont évidemment pas utilisés en thérapeutique dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Synthèse… (exemples de souches) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-2- Les divers antibiotiques : classification

Critères de classification utilisés : - Origine - Nature chimique - Mécanisme d’action - Spectre d’action dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Classification… dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Classification… Pénicillines Noyau lactame Noyau pénam dans pénicilline G ou oxacilline Noyau carbapénème dans l’imipeneme Noyau oxapénam dans l’acide clavulanique Céphalosporines Il existe une autre catégorie monobactams (seul cycle le noyau bétalactame) Noyau céphème dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Classification… (antibiothérapie) Exemples de bétalactamines Pénicilline G Céfalotine (C1G) Ampicilline G Céfotaxime (C3G) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-3- Mécanisme d’action dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Mode d’action Replication Paroi Traduction Membrane plasmique Transcription Métabolisme dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Mode d’action… (antibiothérapie) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-4- La résistance aux antibiotiques

Résistances… Comment résistent les bactéries ? Imperméabilité Efflux actif Effet éponge (hyperproduction de la cible) Perte ou modification de la cible Production d’enzymes inactivatrices Utilisation d’une voie détournée (de remplacement) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Résistances… Comment les bactéries acquièrent-elles la résistance ? Résistance naturelle ou acquise - Résistances naturelles : résistances programmées sur le génome bactérien, donc fixes et constantes à l’intérieur du taxon - Résistances acquises : résistances consécutives à des modifications de l’équipement génétique : * mutations (spontanées, stables se transmettant verticalement, spécifiques : 1 seul antibiotique à la fois, rare : taux entre 10-7 et 10-8) * résistances plasmidiques (fréquentes, se transmettant horizontalement entre bactéries cohabitant même d’espèces différentes, pouvant concerner plusieurs antibiotiques différents). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-4-1- Exemples de résistance par imperméabilité
- Résistance acquise par mutations de gènes codant pour des porines permettant le passage des molécules hydrophiles comme les pénicillines à large spectre, les céphalosporines, les aminosides, les phénicoles ou les tétracyclines - Résistance acquise par inactivation du métabolisme oxydatif nécessaire au transport actif des aminosides - Résistance naturelle au transport actif des aminosides des anaérobies strictes dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-4-2- Résistance par efflux actif
Mécanisme : Existence d’une pompe à efflux : système de transport dans la membrane plasmique nécessitant de l’énergie (pompe à efflux) pompant l’antibiotique de l’intérieur vers l’extérieur plus vite qu’il ne rentre Conséquence : Réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique Antibiotiques concernés : tétracyclines, chloramphénicol, fluoroquinolones, macrolides, certaines bétalactamines dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-4-3- Résistance par modification de la cible
- Modification des PLP - Modification de la cible ribosomale - Modification de la cible au niveau de la synthèse des acides nucléiques dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Modification des PLP (PBP) : PLP (protéine de liaison de la pénicilline) : enzyme intervenant dans l’assemblage du peptidoglycane sur la paroi * soit PLP dont l’affinité diminue * soit augmentation de la production de PLP * soit synthèse de nouvelles PLP de faible affinité Résistance pouvant être : * mutationnelle (Staphylococcus, Enterococcus) * acquise par transformation (Streptococcus pneumoniae) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Modification de la cible ribosomale de l’antibiotique Résistance acquise par mutation (résistance aux tétracyclines,aux macrolides, aux phénicoles, plus rarement aux aminosides) * Résistance aux macrolides par méthylation d’une base du 23S r RNA de la sous unité 50S du ribosome * Résistance aux aminoglycosides par modification de la protéine cible sur la sous unité 30 S du ribosome dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Modification de la cible pour la synthèse des acides nucléiques ou synthèse additionnelle d’une cible alternative qui ne réagit pas avec l’antibiotique mais qui continue d’exercer la fonction de la cible originale - Mutation conduisant à une ADN gyrase n’ayant plus d’affinité pour les antibiotiques - Mutation conduisant à la production d’ARN polymérase n’ayant plus d’affinité pour les rifamycines - Modification ou synthèse d’un nouvelle DHPS (dihydrofolate synthétase) ou DHFR (dihydrofolate réductase) fixant moins bien les sulfamides, possibilité de synthèse normale par la bactérie d’acide tétrahydrofolique dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-4-4- Résistance par production d’enzymes inactivatrices
Enzymes inactivant les b lactamines Enzymes inactivant les aminosides Enzymes inactivant les phénicoles Enzymes inhibant les MLS (macrolides, lincosamides, streptogramines) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Les -lactamases Monde des bétalactamases particulièrement complexe. Evolution des bétalactamases : - au fil de l’utilisation des bétalactamines - du fait des progrès des bétalactamines par la pression de sélection. Lecture de l’antibiogramme utile pour la détermination du type de bétalactamase. Deux tableaux tentent de le faire, pour les Entérobactéries et les Pseudomonas. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Les b lactamases * Les pénicillinases - substrat préférentiel pénicilline G, aminopénicillines, carboxypénicilline - autre substrat : les céphalosporines de 1ère génération * Les céphalosporinases - substrat préférentiel les céphalosporines (pouvant toutefois agir sur les pénicillines) * Les BLSE (b lactamases à spectre étendu) - substrat : toutes les b lactamines dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Attention : il existe des inhibiteurs des béta lactamases : - Acide clavulanique - Tazobactam….. Conséquence : l’amoxicilline (pénicilline) associée à l’acide clavulinique (Augmentin) retrouve son activité sur les bactéries résistantes par production de béta lactamases. Remarque : l’acide clavulanique est sans effet sur les céphalosporinases dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Acide clavulanique : bétalactamine particulière

Différentes -lactamases dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Résistances… Quels problèmes posent la résistance ? Sélection des souches résistantes par l’antibiothérapie : risque majeur d’ÉCHEC THÉRAPEUTIQUE chez le malade. risque de sélection dans la flore commensale d’un pathogène opportuniste déclenchant alors une maladie infectieuse (iatrogène). risque de sélection de bactéries résistantes qui peuvent être transmises à d’autres malades, ou, plus subtil, de sélection de souches commensales multirésistantes qui peuvent transmettre à des pathogènes cette multirésistance… dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Effet iatrogène… Effets toxiques de certains antibiotiques : aminosides : ototoxicité (atteinte de l'oreille conduisant à une surdité) tétracyclines : altèrent la minéralisation de l'os et des dents et les colorent chloramphénicol : perturbe l'hématopoïèse provoquant rarement une aplasie. allergies à de nombreux antibiotiques (-lactamines …) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

1-6- Sensibilité aux antibiotiques et taxonomie

Antibiotiques et taxonomie Intérêt de l’ANTIBIOTYPE : pour comparer deux souches du même taxon, on peut comparer leurs antibiogrammes. Identification et connaissance des résistances naturelles confronter les résultats de l’antibiogramme au nom du taxon identifié. S’il s’avère sensible à un Ab pour lequel il y a résistance naturelle, l’identification est à contrôler (l’inverse n’est pas vrai). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2- Etude de la sensibilité des bactéries
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2-1- La CMI (concentration minimale inhibitrice)

Buts : Déterminer les antibiotiques à utiliser pour soigner un malade atteint d’une maladie due à une bactérie ou un champignon. Déterminer le profil de sensibilité aux antimicrobiens d’un microorganisme afin d’obtenir l’antibiotype permettant de préciser son identification. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Le paramètre de base est la CMI, concentration minimum inhibant toute culture visible de la souche. O CMI concentration Pas de culture microbienne Culture microbienne dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche MAIS pour savoir si l’antimicrobien peut ou non être utilisé en pratique pour soigner il ne suffit pas de connaître la CMI… Il faut connaître la concentration de l’antibiotique chez le malade… qui dépend de nombreux paramètres, en particulier la quantité absorbée ou injectée… mais aussi de l’individu (enfant, femme, homme, maigre ou obèse, jeune ou âgé). Pour chaque antibiotique, les études pharmacologiques ont permis de fixer deux paramètres de concentration permettant de déterminer la « sensibilité » du microorganisme : La concentration critique inférieure, représentant la concentration minimum moyenne de l’Ab chez le malade ou la concentration à partir de laquelle le traitement est efficace pour un traitement « normal ». Concentrations critiques La concentration critique supérieure, représentant la concentration moyenne maximale de l’Ab chez le malade dans le cas d’un traitement à haute dose ou la concentration à partir de laquelle le traitement est inefficace. Cette CCS peut aussi être la concentration à partir de laquelle l’Ab devient toxique. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Concentrations critiques Définitions proposées très contestables car les paramètres ainsi déterminés sont avant tout déterminés par l’expérience. CCs : parfois donnée comme une concentration toxique mais il ne faut pas négliger le fait que la concentration d’un produit dépend aussi des caractéristiques de son élimination : il existe forcément une concentration que l’on ne peut dépasser en raison de l’élimination. D’autre part, ces paramètres dépendent évidemment de l’individu… Enfin, les documents des fabricants montrent bien les grandes variations des concentrations en fonction du temps… que le formalisme de laboratoire ne prend pas toujours en compte. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Conclusion possible en comparant la CMI et ces concentrations critiques : Si la CMI est inférieure à la Concentration critique inférieure CCi Chez le malade, la concentration est telle que la souche ne cultive pas. La bactérie est dite SENSIBLE. CMI CCi O Le malade sera guéri par un traitement à dose normale. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Chez le malade, la concentration est telle que la souche cultive malgré un traitement à haute dose. La bactérie est dite RÉSISTANTE. Si la CMI est supérieure à la Concentration critique supérieure CCs CCs CMI O Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose. Cet antibiotique est à rejeter. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Chez le malade, la concentration est telle que la souche n’est inhibée que si le traitement est à haute dose. La bactérie est dite INTERMÉDIAIRE. Si la CMI est entre la Concentration critique supérieure CCs et inférieure CCi CCi CMI CCs O Le malade ne pourra être guéri QUE par un traitement à haute dose. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche Les trois catégories : CMI CCi La bactérie est dite SENSIBLE. O Le malade sera guéri par un traitement à dose normale. CMI CCs CCi La bactérie est dite INTERMÉDIAIRE. O Le malade ne pourra être guéri que par un traitement à haute dose. CCs CMI La bactérie est dite RÉSISTANTE. O Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2-2- Détermination de la CMI en milieu liquide

Caractères d’une souche
Mesure t en microplaque ou en tube à hémolyse en réalisant des dilutions successives de l’antibiotique, en ajoutant un milieu de culture avec ou sans indicateur de pH, des bactéries, puis en lisant après l’incubation la présence ou non de culture. Concentrations finales de l’antibiotique (ou antibactérien) en µg/mL Cupule témoin sans Ab 1024 512 256 256 128 64 32 16 8 4 2 1 La concentration la plus forte pour laquelle il y a culture (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration précédente (pas de culture) est supérieure ou égale à la CMI. Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs. Ici : 2 µg/mL ≥ CMI > 1 µg/mL souvent résumée à 2 µg/mL 0,5 0,25 0,125 E. coli 37°C - 24 h dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Caractères d’une souche
Autre mesure à l’aide d’un indicateur de pH : le milieu est glucosé et du rouge de phénol a été ajouté. La lecture utilisera donc le virage que le témoin doit confirmer. Concentrations finales de l’antibiotique (ou antibactérien) en µg/mL Cupule témoin sans Ab 1024 512 256 256 128 64 32 16 8 4 2 1 La concentration la plus forte pour laquelle il y a virage (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration juste précédente (sans virage) est supérieure ou égale à la CMI. Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs. Ici : 1 µg/mL ≥ CMI > 0,5 µg/mL (résumée à 1 µg/mL) 0,5 0,25 0,125 Salmonella 37°C - 24 h dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2-3- ANTIBIOGRAMME STANDARD PAR LA MÉTHODE DES DISQUES

Principe du test Sur la boîte de milieu, dépôt d’ un disque d’Ab (contenant une charge définie) L’Ab passe immédiatement dans la gélose (dans un cylindre de même diamètre que le disque) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Principe du test L’Ab diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Principe du test Vu par dessus : L’Ab diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Détermination de la CMI On peut représenter la diffusion de l’Ab de la façon suivante : La relation entre le diamètre (ou le rayon) d’inhibition et la concentration de l’Ab n’est pas de proportionnalité. Elle peut être représentée par une droite en coordonnées logarithmiques dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Détermination de la CMI La relation est donc linéaire : Log(C) = k d + b. Pour déterminer les valeurs des constantes, on dispose des valeurs de Cci,di et CCs,ds. Les valeurs trouvées sont comprises dans certaines limites… Il ne faut pas leur donner plus d’exactitude que nécessaire ! Un CV de 10 à 30 % est raisonnable ! dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Détermination de la CMI par antibiogramme Nécessité que la technique soit standardisée pour être reproductible et comparer - le diamètre obtenu avec la souche testée - et le diamètre * D (d Cci) correspondant à la Cci * d (dCCs) correspondant à la CCs Exigences de la standardisation : - Milieu riche : milieu de Mueller Hinton (infusion de viande de bœuf, caséine, amidon de maïs, Mg2+ et Ca2+ avec possibilité d’addition de substances pour les bactéries exigeantes - Milieu toujours de 4 mm d’épaisseur - Technique standardisée (recommandation de la SFM). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Détermination de la CMI par antibiogramme : technique Nécessité de suivre les recommandations fournies par la SFM à suivre afin de pouvoir interpréter les résultats dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Détermination de la CMI par antibiogramme : technique - Suspension en eau physiologique de trouble équivalent à 0,5 Mac Farland Dilution au 1/10 de cette suspension Etalement de la dilution à la surface de la gélose à l’aide d’un écouvillon stérile imbibé sans excès (croisement des passages sans oubli des bords) Dépôt des disques à l’aide d’un gabarit Incubation, boîte retournée Lecture : mesure du diamètre des zones d’inhibition. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Principe du test C < CCi On pourra donc placer les Concentrations critiques. CCi CCs CCs<C < CCi C > CCs dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Principe du test Concentration = CMI Si la souche est SENSIBLE, elle cultivera de la façon suivante : CCi CCs dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Lecture du test Pour la lecture il faut donc, pour chaque antibiotique : mesurer les diamètres de la zone d’inhibition (en mm), comparer aux diamètres critiques correspondant aux concentrations critiques, conclure. di = 16 mm Cci = 4 µg/mL CCs = 8 µg/mL Diamètre = 19 mm ds = 14 mm dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Lecture du test Observer et conclure : CCi CCs Disque de céfotaxime 30 µg dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Rendu des résultats Nom de l’antibiotique Sigle Diamètre d’ inhibition en mm Valeur de la CCs en mg/mL Diamètre correspondant à la CCs Valeur de la Cci Résultat R/I/S Valeur approchée de la CMI en mg/mL Ampicilline AM Acide fusidique FA dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Abaque de lecture (disparu) Diagnostics Pasteur éditait des abaques pour la lecture de l’antibiogramme (voir Dictionnaire des techniques). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Abaque de lecture diamètres concentrations dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2-4- ANTIBIOGRAMME PAR LA MÉTHODE en deux Concentrations critiques

Méthode ATB Conclusion : CCs pour les cupules de la
colonne de droite Cci pour les cupules de la colonne Témoin (pas d’Ab) Chaque cupule contient : L’antibiotique à CC Le milieu de Mueller Hinton additionné des bactéries. Amoxicilline Conclusion : S’il y a culture c’est que l’Ab à la concentration de la cupule n’est pas actif, et inversement. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Méthode ATB Les témoins de culture étant conformes,
Pas de culture : souche SENSIBLE Culture aux deux concentrations : souche RÉSISTANTE Culture uniquement avec la Cci souche INTERMÉDIAIRE Culture uniquement avec le CCs : théoriquement IMPOSSIBLE Dans certaines galeries, seule une CC est testée. Il s’agit de la Cci. On ne pourra conclure que Sensible ou Résistant. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Méthode ATB : exemple Les témoins de culture étant conformes, Résistance à TIC et MEC Intermédiaire à CFT Une seule CC : donc Sensible à CTX et sensible à CAZ Sensibilité à CFM dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2-5- Le E test dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Existence d’autres méthodes dont certaines semi-automatiques depuis une vingatine d'années. E-test : Gradient de concentrations d‘un antibiotique donné dans une bandelette plastifiée (une bandelette par antibiotique) Dépôt de l'une de celle-ci à la surface d'une boite de Pétri ensemencée par la suspension de la bactérie à tester Incubation à 37°C Lecture directe de la valeur de la CMI au niveau de la zone à lire. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

3- Approfondissement apporté par l’observation précise des antibiogrammes dimanche 26 mars 2017dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Quelques exemples d’antibiogrammes Stenotrophomonas maltophilia Bactérie multirésistante même aux bétalactamines de choc (CTX : céfotaxine, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, IPM : imipénème)! Mais sensible aux aminosides ( GM : gentamycine, AN 30 : amikacine) et quinolones de 2e génération (OFX : ofloxacine) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Quelques exemples d’antibiogrammes Streptococcus agalactiae (B) Sur milieu de Mueller Hinton au sang frais. E : erythromycine VA : vancomycine *CF : céfalotine AM : ampicilline P : pénicilline Te : tétracycline dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Quelques exemples d’antibiogrammes Hafnia alvei Bien observer, en particulier les zones non circulaires autour des disques : deux Ab peuvent voir leurs effets se contredire ou au contraire s’ajouter. Observer L’antagonisme La souche est sensible à CTX (céfotaxine). La souche est R à AMC : la BL n’est pas inhibée ou peu inhibée par AC ou un autre mécanisme est mis en jeu. Mais l’antagonisme montre une R étonnante : on peut penser que la bétalactamase agissant sur CTX apparaît sous l’action de l’acide clavulanique qui agirait comme inducteur de la synthèse. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

3-1- Association d’antibiotiques Buts : L’idée d’un bi ou trithérapie est évidente face à une infection grave : on imagine facilement que deux Ab seront plus efficaces qu’un seul . MAIS ce n’est pas forcément obligatoire ! Deux molécules peuvent se « contredire ». On doit donc tester, dans des cas particuliers, des associations d’antibiotiques. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Associations (méthodes des bandes) La souche est ensemencée par inondation. On dépose deux bandes de papier imprégnée d’Ab (on peut aussi utiliser une série de disques) Examiner l’effet de l’association au niveau de la zone où les deux Ab sont présents. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Associations (méthodes des bandes) Dans cet exemple réel, aucun effet n’est observé dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Associations (observation des boîtes) En observant de façon attentive les boîtes, il est possible de détecter l’effet d’associations. C’est en particulier le cas avec AMC (Amoxicilline + Acide clavulanique) mais peut se produire pour d’autres Ab. Souche de Pseudomonas aeruginosa. FOX = Fosfomycine On voit donc ici des antagonismes. Observer ici les cercles d’inhibition qui ne sont justement pas circulaires… AMC = amoxicilline + Acide clavulanique CAZ = ceftazidile (C3G) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Associations Hafnia alvei Noter que la souche est S à AM (ampicilline) et R à AMC (amoxicilline + acide clavulanique) : c’est surprenant ! Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone d’antagonisme apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et TIC (ticarcilline), entre AMC et MA (céfamandole) et entre IPM(imipénème) et AM. La souche devient donc résistante : une enzyme inductible a du être produite, enzyme induite par l’acide clavulanique et l’l’imipénème. Ainsi s’explique la R à l’AMC alors que la souche est S à AM… dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Associations Klebsiella pneumoniae Noter que la souche est R à AM (amoxicilline) et S à AMC : une bétalactamase sensible à l’acide clavulanique (AC) est présente. Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone de synergie apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et MA (céfamandole). L’acide clavulanique inhibe manifestement, à faible concentration, les enzymes agissant sur MA et CTX. Cela signe une bétalactamase à spectre élargi, une BLSE. qui va conduire in vivo à une résistance à toutes les bétalactamines Ces enzymes hydrolysent toutes les bétalactamines mais sont sensibles aux inhibiteurs de bétalactamase. Elles ne sont détectées que par la synergie (ou l’amplification génique) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Cas particulier : Serratia

Serratia marcescens et colistine Autour du disque de Colistine ou Colimycine, un aspect en COCARDE peut être trouvé pour Serratia en particulier dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Cas particulier : Staphylococcus aureus

Résistance hétérogène des Staphylococcus Les Staphylococcus, et en particulier aureus, présentent une stabilité génétique limitée. On peut le voir en macroscopie dans un isolement réalisé à partir d’une colonie : Observer les tailles variées des colonies ainsi que les variations de pigmentation. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Résistance hétérogène des Staphylococcus L’inoculum est à forte concentration en Staphylococcus. Il est étalé sur des milieux contenant de la vancomycine qui va donc sélectionner les R. Noter le nombre de R en fonction de la C en vancomycine… On peut donc voir que, dans la population initiale, issue d’un clone, toutes les bactéries ne possèdent pas la même CMI vis-à-vis de la vancomycine : la population est hétérogène. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Résistance hétérogène des Staphylococcus Dans le cas particulier des bétalactamines, on retrouve le même problème : certains souches sont HÉTÉROGÈNES et présentent donc à partir d’un même clone : des colonies sensibles des colonies résistants Ils ne sont visibles que dans des conditions particulières : culture à 30°C culture en milieu hypersalé Et uniquement pour la méticilline (qui n’existe plus) ou l’oxacilline (Pénicillines M). La résistance peut évidemment être homogène. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Cas particulier : Streptococcus, Enterococcus

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Les Streptococcus et les Enterococcus sont naturellement résistants aux AMINOSIDES par défaut de pénétration, la chaîne respiratoire, absente, étant probablement le transporteur transmembranaire. En présence de bétalactamines, les aminosides peuvent toutefois pénétrer dans les bactéries. Mais leur activité va dépendre de la CIBLE, une protéine du ribosome : l’antibiotique peut ou non être actif. La technique de mise en évidence va utiliser des disques À HAUTE CHARGE provoquant la pénétration forcée de l’antibiotique dans la bactérie. Quand la cible est résistante on parle de haut niveau de résistance. Quand la cible est sensible, on parle de bas niveau de résistance : la souche reste R à l’aminoside mais devient S en cas d’association aminoside-bétalactamine. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Voici un test réalisé avec 3 aminosides : Streptomycine (S), Kanamycine (K) et Gentamycine (G) Avec : disques normaux d’antibiotiques (charge normale de 15 µg) disques à haute charge (500 ou 1000 µg) notés HC S SHC GHC G K Il s’agit ici d’une souche sauvage : elle est R aux aminosides à charge normale et « S » aux aminosides très chargés. KHC dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas B S SHC GHC Il s’agit ici d’une souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à Haut niveau de R à S à bas niveau de R à G et K G K KHC dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas D S SHC GHC Il s’agit ici d’une souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à haut niveau de R à G et K à bas niveau de R à S G K KHC dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas E S SHC GHC Il s’agit ici d’une souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à haut niveau de R à tous ces aminosides. G K KHC dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

3-2- Détection des résistances aux antibiotiques Les différentes techniques abordées sont : le test de GOTS le test à la céphalosporine chromogène l’observation de l’antibiogramme dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test de GOTS Le test de GOTS permet de rechercher le mécanisme de résistance d’une souche à un antibiotique, plus précisément l’existence de synthèse d’enzyme de destruction ou d’inactivation de l’antibiotique. Il utilise : - une souche sensible - les souches résistantes à tester - et l’antibiotique correspondant pour lequel on recherche la résistance. Les souches testées sont caractérisées par leur capacité de LEVÉE DE L’INHIBITION DE LA CULTURE DE LA SOUCHE SENSIBLE. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test de GOTS : technique Chaque souche testée est placée sur la gélose par une strie partant près du disque et se dirigeant vers le bord de la boite. La boite est incubée à 37°C (en général). Sur la gélose ensemencée est placé le disque d’antibiotique pour lequel la souche est sensible et pour lequel la résistance est recherchée. Une gélose pour antibiogramme est ensemencée avec la souche sensible, par inondation ou mieux par incorporation. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test de GOTS : technique
Observer l’effet de la souche testée sur la souche sensible : constater une culture paradoxale ici. Une fois incubée, voici les résultats obtenus. Constater l’effet de l’antibiotique sur la souche Constater la présence de culture En toute logique les souches tests doivent cultiver près du disque ! Dans ce cas, remarquer l’absence d’interférence : pas de culture paradoxale ici. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test de GOTS : exemples Disque d’érythromycine. A : témoin positif D : témoin négatif B et C souches essai. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test Céphalosporine chromogène Le test à la céphalosporine chromogène utilise une céphalosporine couplée à un chromogène. Cette molécule est incolore. Les bactéries sont alors ajoutées à partir d’une gélose. Si une bétalactamase est présente dans les bactéries, la céphalosporine chromogène est hydrolysée provoquant l’apparition du chromogène libéré rose. ATTENTION : soit l’enzyme est CONSTITUTIVE et la bactérie la possède toujours, soit elle est INDUITE et la bactérie doit être prélevée sur un milieu avec inducteur (bétalactamine). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Test Céphalosporine chromogène Un test à la céphalosporine chromogène est commercialisé par biomérieux sous le nom de Cefinase®. Il est imprégné d’eau puis les bactéries sont déposées à la pipette Pasteur. En voici un résultat (souche d’Haemophilus influenzae) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

OBSERVATION DE L’ANTIBIOGRAMME

AMX(amoxicilline) /AMC (amoxicilline + acide clavulanique) dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Observation AM/AMC L’acide clavulanique est une bétalactamine particulière : Il inhibe les bétalactamases (du moins un certain nombre). dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Observation AM/AMC Si une souche possède une bétalactamase, elle devient R à l’Ampicilline (AM) ou à l’Amoxicilline (AMX). Si cette bétalactamase est sensible à l’acide clavulanique (AC), et si la bactérie est sensible à AM ou AMX, alors elle devient S à AMC (=AMX + AC). Voici un exemple montrant la Sensibilité à AMC et la Résistance à AM. (souche d’Haemophilus influenzae sur gélose Chocolat enrichie) Cette souche montre, dans le test Cefinase ,une bétalactamase. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2. Colonies « squatters » dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Observation autour d’une bétalactamine On peut observer les colonies en limite de zone d'inhibition autour d ‘un disque de bétalactamine : Colonies « squatters » Des colonies débordant légèrement signent la présence probable d’une bétalactamase. dimanche 26 mars 2017 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

Étude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiques

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