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Vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 1 Étude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiques.

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1 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 1 Étude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiques

2 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 2 1- Antibiotiques : généralités

3 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Définition

4 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 4 Penicillium Staphylococcus aureus Découverte… Lantibiothérapie

5 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 5 Découverte (antibiothérapie) Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures. Un jour il ensemence une bo î te avec du S. aureus et oublie la boite sur la paillasse. Quelques jours plus tard, il constate lapparition dun champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone dinhibition autour du Staphylococcus. Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque. Staphylococcus aureus Penicillium

6 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 6 Distinguer Antibiotiques et Antiseptiques Les antiseptiques (comme l'eau de Javel) sont des molécules - toxiques pour les microorganismes, - aussi toxiques pour les cellules eucaryotes - toxiques à des doses importantes (de l'ordre du g ou du mg cm -3 ). Au contraire les antibiotiques sont : - des molécules toxiques pour certains microorganismes et non pour d'autres, ce qui signe une spécificité d'action absente chez les antiseptiques. - des molécules peu toxiques pour les cellules animales - des molécules toxiques pour leurs cibles à des concentrations faibles (de l'ordre du µg cm -3 )

7 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 7 Définition… (antibiothérapie) Un antibiotique est une molécule toxique (statique ou cide) pour un groupe cible de microorganismes (bactéries, champignons, virus, parasites eucaryotes …) de mode d'action spécifique active à des concentrations faibles de l'ordre du µg.cm -3 généralement synthétisé par un microorganisme mais souvent modifié chimiquement ou même synthétisé entièrement par les Chimistes. peu toxique pour les cellules eucaryotes supérieures en pratique donc utilisables par voie générale. Existent des antibiotiques anti-fongiques, anti-bactériens, et à la limite anti-parasites. Des antibiotiques anti-bactériens comme le métronidazole ou les sulfamides qui sont aussi actifs sur certains parasites eucaryotes … ce qui justifie une définition large du terme antibiotique ! Des antibiotiques toxiques existent mais ne sont évidemment pas utilisés en thérapeutique

8 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 8 Synthèse… (exemples de souches)

9 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Les divers antibiotiques : classification

10 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 10 Critères de classification utilisés : - Origine - Nature chimique - Mécanisme daction - Spectre daction

11 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 11 Classification…

12 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 12 Classification…

13 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 13 Classification… Noyau lacta me Pénicillines Noyau pénam dans pénicilline G ou oxacilline Noyau carbapénème dans limipeneme Noyau oxapénam dans lacide clavulanique Céphalosporines Il existe une autre catégorie monobactams (seul cycle le noyau bétalactame) Noyau céphème

14 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 14 Classification… (antibiothérapie) Pénicilline G Ampicilline G Céfalotine (C1G) Céfotaxime (C3G) Exemples de bétalactamines

15 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Mécanisme daction

16 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 16 Mode daction Paroi Membrane plasmique Transcription Replication Traduction Métabolisme

17 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 17 Mode daction… (antibiothérapie)

18 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier La résistance aux antibiotiques

19 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 19 Résistances… Imperméabilité Comment résistent les bactéries ? Efflux actif Effet éponge (hyperproduction de la cible) Perte ou modification de la cible Production denzymes inactivatrices Utilisation dune voie détournée (de remplacement)

20 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 20 Résistances… Comment les bactéries acquièrent-elles la résistance ? Résistance naturelle ou acquise - Résistances naturelles : résistances programmées sur le génome bactérien, donc fixes et constantes à lintérieur du taxon - Résistances acquises : résistances consécutives à des modifications de léquipement génétique : * mutations (spontanées, stables se transmettant verticalement, spécifiques : 1 seul antibiotique à la fois, rare : taux entre et ) * résistances plasmidiques (fréquentes, se transmettant horizontalement entre bactéries cohabitant même despèces différentes, pouvant concerner plusieurs antibiotiques différents).

21 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Exemples de résistance par imperméabilité - Résistance acquise par mutations de gènes codant pour des porines permettant le passage des molécules hydrophiles comme les pénicillines à large spectre, les céphalosporines, les aminosides, les phénicoles ou les tétracyclines - Résistance acquise par inactivation du métabolisme oxydatif nécessaire au transport actif des aminosides - Résistance naturelle au transport actif des aminosides des anaérobies strictes

22 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Résistance par efflux actif Mécanisme : Existence dune pompe à efflux : système de transport dans la membrane plasmique nécessitant de lénergie (pompe à efflux) pompant lantibiotique de lintérieur vers lextérieur plus vite quil ne rentre Conséquence : Réduction de la concentration intracellulaire de lantibiotique Antibiotiques concernés : tétracyclines, chloramphénicol, fluoroquinolones, macrolides, certaines bétalactamines

23 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Résistance par modification de la cible - Modification des PLPPLP - Modification de la cible ribosomalecible ribosomale - Modification de la cible au niveau de la synthèse des acides nucléiquesacides nucléiques

24 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Modification des PLP (PBP) : PLP (protéine de liaison de la pénicilline) : enzyme intervenant dans lassemblage du peptidoglycane sur la paroi * soit PLP dont laffinité diminue * soit augmentation de la production de PLP * soit synthèse de nouvelles PLP de faible affinité Résistance pouvant être : * mutationnelle (Staphylococcus, Enterococcus) * acquise par transformation (Streptococcus pneumoniae)pneumoniae

25 Modification de la cible ribosomale de lantibiotique Résistance acquise par mutation (résistance aux tétracyclines,aux macrolides, aux phénicoles, plus rarement aux aminosides) * Résistance aux macrolides par méthylation dune base du 23S r RNA de la sous unité 50S du ribosome * Résistance aux aminoglycosides par modification de la protéine cible sur la sous unité 30 S du ribosomeribosome vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 25

26 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Modification de la cible pour la synthèse des acides nucléiques ou synthèse additionnelle dune cible alternative qui ne réagit pas avec lantibiotique mais qui continue dexercer la fonction de la cible originale - Mutation conduisant à une ADN gyrase nayant plus daffinité pour les antibiotiques - Mutation conduisant à la production dARN polymérase nayant plus daffinité pour les rifamycines - Modification ou synthèse dun nouvelle DHPS (dihydrofolate synthétase) ou DHFR (dihydrofolate réductase) fixant moins bien les sulfamides, possibilité de synthèse normale par la bactérie dacide tétrahydrofolique

27 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Résistance par production denzymes inactivatrices - Enzymes inactivant les lactamines - Enzymes inactivant les aminosides - Enzymes inactivant les phénicoles - Enzymes inhibant les MLS (macrolides, lincosamides, streptogramines)

28 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Les -lactamases Monde des bétalactamases particulièrement complexe. Evolution des bétalactamases : - au fil de lutilisation des bétalactamines - du fait des progrès des bétalactamines par la pression de sélection. Lecture de lantibiogramme utile pour la détermination du type de bétalactamase. Deux tableaux tentent de le faire, pour les Ent é robact é ries et les Pseudomonas.

29 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 29 Les lactamases * Les pénicillinases - substrat préférentiel pénicilline G, aminopénicillines, carboxypénicilline - autre substrat : les céphalosporines de 1 ère génération * Les céphalosporinases - substrat préférentiel les céphalosporines (pouvant toutefois agir sur les pénicillines) * Les BLSE ( lactamases à spectre étendu) - substrat : toutes les lactamines

30 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 30 Attention : il existe des inhibiteurs des béta lactamases : - Acide clavulanique - Tazobactam….. Conséquence : lamoxicilline (pénicilline) associée à lacide clavulinique (Augmentin) retrouve son activité sur les bactéries résistantes par production de béta lactamases. Remarque : lacide clavulanique est sans effet sur les céphalosporinases

31 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 31 Acide clavulanique : bétalactamine particulière

32 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 32 Différentes -lactamases

33 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 33 Résistances… Sélection des souches résistantes par lantibiothérapie : Quels problèmes posent la résistance ? risque majeur dÉCHEC THÉRAPEUTIQUE chez le malade. risque de sélection dans la flore commensale dun pathogène opportuniste déclenchant alors une maladie infectieuse (iatrogène). risque de sélection de bactéries résistantes qui peuvent être transmises à d autres malades, ou, plus subtil, de s é lection de souches commensales multir é sistantes qui peuvent transmettre à des pathog è nes cette multir é sistance …

34 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 34 Effet iatrogène… Effets toxiques de certains antibiotiques : aminosides : ototoxicité (atteinte de l'oreille conduisant à une surdité) tétracyclines : altèrent la minéralisation de l'os et des dents et les colorent chloramphénicol : perturbe l'hématopoïèse provoquant rarement une aplasie. allergies à de nombreux antibiotiques ( -lactamines …)

35 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Sensibilité aux antibiotiques et taxonomie

36 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 36 Antibiotiques et taxonomie Intérêt de l ANTIBIOTYPE : pour comparer deux souches du même taxon, on peut comparer leurs antibiogrammes. Identification et connaissance des résistances naturelles confronter les résultats de lantibiogramme au nom du taxon identifié. Sil savère sensible à un Ab pour lequel il y a résistance naturelle, lidentification est à contrôler (l inverse n est pas vrai).

37 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Etude de la sensibilité des bactéries

38 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier La CMI (concentration minimale inhibitrice)

39 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Buts : Déterminer les antibiotiques à utiliser pour soigner un malade atteint dune maladie due à une bactérie ou un champignon. Déterminer le profil de sensibilité aux antimicrobiens dun microorganisme afin dobtenir lantibiotype permettant de préciser son identification.

40 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Caractères dune souche Culture microbienne Pas de culture microbienne Le paramètre de base est la CMI, concentration minimum inhibant toute culture visible de la souche. OCMI concentration

41 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 41 Caractères dune souche Concentrations critiques La concentration critique inférieure, représentant la concentration minimum moyenne de lAb chez le malade ou la concentration à partir de laquelle le traitement est efficace pour un traitement « normal ». MAIS pour savoir si lantimicrobien peut ou non être utilis é en pratique pour soigner il ne suffit pas de conna î tre la CMI … Il faut conna î tre la concentration de l antibiotique chez le malade … qui d é pend de nombreux param è tres, en particulier la quantit é absorb é e ou inject é e … mais aussi de l individu (enfant, femme, homme, maigre ou ob è se, jeune ou âg é ). Pour chaque antibiotique, les études pharmacologiques ont permis de fixer deux paramètres de concentration permettant de déterminer la « sensibilité » du microorganisme : La concentration critique supérieure, représentant la concentration moyenne maximale de lAb chez le malade dans le cas dun traitement à haute dose ou la concentration à partir de laquelle le traitement est inefficace. Cette CCS peut aussi être la concentration à partir de laquelle l Ab devient toxique.

42 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 42 Caractères dune souche Concentrations critiques Définitions proposées très contestables car les paramètres ainsi déterminés sont avant tout déterminés par lexpérience. CCs : parfois donnée comme une concentration toxique mais il ne faut pas négliger le fait que la concentration dun produit dépend aussi des caractéristiques de son élimination : il existe forcément une concentration que lon ne peut dépasser en raison de lélimination. Dautre part, ces paramètres dépendent évidemment de lindividu… Enfin, les documents des fabricants montrent bien les grandes variations des concentrations en fonction du temps… que le formalisme de laboratoire ne prend pas toujours en compte.

43 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 43 Caractères dune souche Conclusion possible en comparant la CMI et ces concentrations critiques : Si la CMI est inférieure à la Concentration critique inférieure CCi O CMI CCi Chez le malade, la concentration est telle que la souche ne cultive pas. La bactérie est dite SENSIBLE. Le malade sera guéri par un traitement à dose normale.

44 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 44 Caractères dune souche Si la CMI est supérieure à la Concentration critique supérieure CCs O CMI CCs Chez le malade, la concentration est telle que la souche cultive malgré un traitement à haute dose. La bactérie est dite RÉSISTANTE. Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose. Cet antibiotique est à rejeter.

45 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 45 Caractères dune souche Si la CMI est entre la Concentration critique supérieure CCs et inférieure CCi O CMI CCs Chez le malade, la concentration est telle que la souche nest inhibée que si le traitement est à haute dose. La bactérie est dite INTERMÉDIAIRE. Le malade ne pourra être guéri QUE par un traitement à haute dose. CCi

46 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 46 Caractères dune souche Les trois catégories : O CMI CCs La bactérie est dite INTERMÉDIAIRE. Le malade ne pourra être guéri que par un traitement à haute dose. CCi O CMI CCs La bactérie est dite RÉSISTANTE. Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose. O CMI CCi La bactérie est dite SENSIBLE. Le malade sera guéri par un traitement à dose normale.

47 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Détermination de la CMI en milieu liquide

48 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 48 Caractères dune souche Cupule témoin sans Ab La concentration la plus forte pour laquelle il y a culture (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration précédente (pas de culture) est supérieure ou égale à la CMI. Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs. Ici : 2 µg/mL CMI > 1 µg/mL souvent résumée à 2 µg/mL Mesure t en microplaque ou en tube à hémolyse en réalisant des dilutions successives de lantibiotique, en ajoutant un milieu de culture avec ou sans indicateur de pH, des bactéries, puis en lisant après lincubation la présence ou non de culture ,50,250,125 Concentrations finales de lantibiotique (ou antibactérien) en µg/mL E. coli 37°C - 24 h

49 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 49 Caractères dune souche Cupule témoin sans Ab La concentration la plus forte pour laquelle il y a virage (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration juste précédente (sans virage) est supérieure ou égale à la CMI. Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs. Ici : 1 µg/mL CMI > 0,5 µg/mL (résumée à 1 µg/mL) Autre mesure à laide dun indicateur de pH : le milieu est glucosé et du rouge de phénol a été ajouté. La lecture utilisera donc le virage que le témoin doit confirmer ,50,250,125 Concentrations finales de lantibiotique (ou antibactérien) en µg/mL Salmonella 37°C - 24 h

50 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier ANTIBIOGRAMME STANDARD PAR LA MÉTHODE DES DISQUES

51 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Principe du test LAb passe immédiatement dans la gélose (dans un cylindre de même diam è tre que le disque) Sur la bo î te de milieu, d é pôt d un disque d Ab (contenant une charge d é finie)

52 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 52 Principe du test LAb diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration.

53 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 53 Principe du test Vu par dessus : LAb diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration.

54 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 54 Détermination de la CMI On peut représenter la diffusion de lAb de la façon suivante : La relation entre le diamètre (ou le rayon) dinhibition et la concentration de lAb nest pas de proportionnalité. Elle peut être représentée par une droite en coordonnées logarithmiques

55 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 55 Détermination de la CMI La relation est donc linéaire : Log(C) = k d + b. Pour déterminer les valeurs des constantes, on dispose des valeurs de Cci,di et CCs,ds. Les valeurs trouvées sont comprises dans certaines limites… Il ne faut pas leur donner plus dexactitude que nécessaire ! Un CV de 10 à 30 % est raisonnable !

56 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 56 Détermination de la CMI par antibiogramme Nécessité que la technique soit standardisée pour être reproductible et comparer - le diamètre obtenu avec la souche testée - et le diamètre * D (d Cci) correspondant à la Cci * d (dCCs) correspondant à la CCs Exigences de la standardisation : - Milieu riche : milieu de Mueller Hinton (infusion de viande de bœuf, caséine, amidon de maïs, Mg2+ et Ca2+ avec possibilité daddition de substances pour les bactéries exigeantes - Milieu toujours de 4 mm dépaisseur - Technique standardisée (recommandation de la SFM).

57 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 57 Détermination de la CMI par antibiogramme : technique Nécessité de suivre les recommandations fournies par la SFM à suivre afin de pouvoir interpréter les résultats

58 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 58 Détermination de la CMI par antibiogramme : technique - Suspension en eau physiologique de trouble équivalent à 0,5 Mac Farland - Dilution au 1/10 de cette suspension - Etalement de la dilution à la surface de la gélose à laide dun écouvillon stérile imbibé sans excès (croisement des passages sans oubli des bords) - Dépôt des disques à laide dun gabarit - Incubation, boîte retournée - Lecture : mesure du diamètre des zones dinhibition.

59 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 59 Principe du test On pourra donc placer les Concentrations critiques. CCi CCs C < CCi C > CCs CCs

60 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 60 Principe du test Si la souche est SENSIBLE, elle cultivera de la façon suivante : CCi CCs Concentration = CMI

61 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 61

62 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Lecture du test Pour la lecture il faut donc, pour chaque antibiotique : mesurer les diamètres de la zone dinhibition (en mm), comparer aux diamètres critiques correspondant aux concentrations critiques, conclure. Cci = 4 µg/mL CCs = 8 µg/mL Diamètre = 19 mm di = 16 mm ds = 14 mm

63 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Lecture du test Observer et conclure : CCi CCs Disque de céfotaxime 30 µg

64 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Rendu des résultats Nom de lantibiotique Sigle Diamètre d inhibition en mm Valeur de la CCs en g/mL Diamètre correspon dant à la CCs en mm Valeur de la Cci en g/mL Diamètre correspon dant à la CCs Résultat R/I/S Valeur approchée de la CMI en g/mL AmpicillineAM Acide fusidique FA

65 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 65 Abaque de lecture (disparu) Diagnostics Pasteur éditait des abaques pour la lecture de lantibiogramme (voir Dictionnaire des techniques).

66 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 66 Abaque de lecture concentrations diamètres

67 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier ANTIBIOGRAMME PAR LA MÉTHODE en deux Concentrations critiques

68 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 68 Méthode ATB Conclusion : Sil y a culture cest que lAb à la concentration de la cupule nest pas actif, et inversement. CCs pour les cupules de la colonne de droite Cci pour les cupules de la colonne Témoin (pas dAb) Amoxicilline Chaque cupule contient : Lantibiotique à CC Le milieu de Mueller Hinton additionné des bactéries.

69 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 69 Méthode ATB Dans certaines galeries, seule une CC est testée. Il sagit de la Cci. On ne pourra conclure que Sensible ou Résistant. Pas de culture : souche SENSIBLE Culture aux deux concentrations : souche RÉSISTANTE Culture uniquement avec la Cci souche INTERMÉDIAIRE Culture uniquement avec le CCs : théoriquement IMPOSSIBLE Les témoins de culture étant conformes,

70 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 70 Méthode ATB : exemple Résistance à TIC et MEC Sensibilité à CFM Intermédiaire à CFT Une seule CC : donc Sensible à CTX et sensible à CAZ Les témoins de culture étant conformes,

71 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Le E test

72 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 72 Existence dautres méthodes dont certaines semi-automatiques depuis une vingatine d'années. E-test : Gradient de concentrations dun antibiotique donné dans une bandelette plastifiée (une bandelette par antibiotique) Dépôt de l'une de celle-ci à la surface d'une boite de Pétri ensemencée par la suspension de la bactérie à tester Incubation à 37°C Lecture directe de la valeur de la CMI au niveau de la zone à lire.

73 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 73

74 3- Approfondissement apporté par lobservation précise des antibiogrammes vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 74

75 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 75 Quelques exemples dantibiogrammes Stenotrophomonas maltophilia Bactérie multirésistante même aux bétalactamines de choc (CTX : céfotaxine, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, IPM : imipénème)! Mais sensible aux aminosides ( GM : gentamycine, AN 30 : amikacine) et quinolones de 2 e génération (OFX : ofloxacine)

76 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 76 Quelques exemples dantibiogrammes Streptococcus agalactiae (B) Sur milieu de Mueller Hinton au sang frais. E : erythromycine VA : vancomycine *CF : céfalotine AM : ampicilline P : pénicilline Te : tétracycline

77 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 77 Quelques exemples dantibiogrammes Hafnia alvei Bien observer, en particulier les zones non circulaires autour des disques : deux Ab peuvent voir leurs effets se contredire ou au contraire sajouter. Observer Lantagonisme La souche est sensible à CTX (céfotaxine). La souche est R à AMC : la BL nest pas inhibée ou peu inhibée par AC ou un autre mécanisme est mis en jeu. Mais lantagonisme montre une R étonnante : on peut penser que la bétalactamase agissant sur CTX apparaît sous laction de lacide clavulanique qui agirait comme inducteur de la synthèse.

78 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Association dantibiotiques Buts : Lidée dun bi ou trithérapie est évidente face à une infection grave : on imagine facilement que deux Ab seront plus efficaces quun seul. MAIS ce nest pas forcément obligatoire ! Deux molécules peuvent se « contredire ». On doit donc tester, dans des cas particuliers, des associations dantibiotiques.

79 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 79 Associations (méthodes des bandes) La souche est ensemencée par inondation. On dépose deux bandes de papier imprégnée dAb (on peut aussi utiliser une série de disques) Examiner leffet de lassociation au niveau de la zone où les deux Ab sont présents.

80 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 80 Associations (méthodes des bandes) Dans cet exemple réel, aucun effet nest observé

81 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 81 Associations (observation des bo î tes) En observant de façon attentive les bo î tes, il est possible de d é tecter l effet d associations. C est en particulier le cas avec AMC (Amoxicilline + Acide clavulanique) mais peut se produire pour d autres Ab. Souche de Pseudomonas aeruginosa. Observer ici les cercles dinhibition qui ne sont justement pas circulaires… On voit donc ici des antagonismes. CAZ = ceftazidile (C3G) AMC = amoxicilline + Acide clavulanique FOX = Fosfomycine

82 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 82 Associations (observation des bo î tes) En observant de façon attentive les bo î tes, il est possible de d é tecter l effet d associations. C est en particulier le cas avec AMC (Amoxicilline + Acide clavulanique) mais peut se produire pour d autres Ab. Souche de Pseudomonas aeruginosa. Observer ici les cercles dinhibition qui ne sont justement pas circulaires… On voit donc ici des antagonismes. CAZ = ceftazidile (C3G) AMC = amoxicilline + Acide clavulanique FOX = Fosfomycine

83 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 83 Associations (observation des bo î tes) En observant de façon attentive les bo î tes, il est possible de d é tecter l effet d associations. C est en particulier le cas avec AMC (Amoxicilline + Acide clavulanique) mais peut se produire pour d autres Ab. Souche de Pseudomonas aeruginosa. Observer ici les cercles dinhibition qui ne sont justement pas circulaires… On voit donc ici des antagonismes. CAZ = ceftazidile (C3G) AMC = amoxicilline + Acide clavulanique FOX = Fosfomycine

84 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 84 Associations Hafnia alvei Noter que la souche est S à AM (ampicilline) et R à AMC (amoxicilline + acide clavulanique) : cest surprenant ! Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone dantagonisme apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et TIC (ticarcilline), entre AMC et MA (céfamandole) et entre IPM(imipénème) et AM. La souche devient donc résistante : une enzyme inductible a du être produite, enzyme induite par l acide clavulanique et l l imip é n è me. Ainsi s explique la R à l AMC alors que la souche est S à AM …

85 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 85 Associations Klebsiella pneumoniae Noter que la souche est R à AM (amoxicilline) et S à AMC : une bétalactamase sensible à lacide clavulanique (AC) est présente. Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone de synergie apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et MA (céfamandole). Lacide clavulanique inhibe manifestement, à faible concentration, les enzymes agissant sur MA et CTX. Cela signe une bétalactamase à spectre élargi, une BLSE. qui va conduire in vivo à une résistance à toutes les bétalactamines Ces enzymes hydrolysent toutes les bétalactamines mais sont sensibles aux inhibiteurs de bétalactamase. Elles ne sont détectées que par la synergie (ou lamplification génique)

86 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 86 Cas particulier : Serratia

87 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 87 Serratia marcescens et colistine Autour du disque de Colistine ou Colimycine, un aspect en COCARDE peut être trouv é pour Serratia en particulier

88 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 88 Cas particulier : Staphylococcus aureus

89 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 89 Résistance hétérogène des Staphylococcus Les Staphylococcus, et en particulier aureus, présentent une stabilité génétique limitée. On peut le voir en macroscopie dans un isolement réalisé à partir dune colonie : Observer les tailles variées des colonies ainsi que les variations de pigmentation.

90 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 90 Résistance hétérogène des Staphylococcus Linoculum est à forte concentration en Staphylococcus. Il est étalé sur des milieux contenant de la vancomycine qui va donc sélectionner les R. Noter le nombre de R en fonction de la C en vancomycine… On peut donc voir que, dans la population initiale, issue dun clone, toutes les bactéries ne possèdent pas la même CMI vis- à -vis de la vancomycine : la population est h é t é rog è ne.

91 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 91 Résistance hétérogène des Staphylococcus Dans le cas particulier des bétalactamines, on retrouve le même probl è me : certains souches sont H É T É ROG È NES et pr é sentent donc à partir d un même clone : des colonies sensibles des colonies résistants Ils ne sont visibles que dans des conditions particulières : culture à 30°C culture en milieu hypersalé Et uniquement pour la méticilline (qui nexiste plus) ou loxacilline (Pénicillines M). La résistance peut évidemment être homog è ne.

92 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 92 Cas particulier : Streptococcus, Enterococcus

93 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 93 Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Les Streptococcus et les Enterococcus sont naturellement résistants aux AMINOSIDES par défaut de pénétration, la cha î ne respiratoire, absente, é tant probablement le transporteur transmembranaire. En présence de bétalactamines, les aminosides peuvent toutefois pénétrer dans les bactéries. Mais leur activité va dépendre de la CIBLE, une protéine du ribosome : lantibiotique peut ou non être actif. Quand la cible est r é sistante on parle de haut niveau de r é sistance. Quand la cible est sensible, on parle de bas niveau de r é sistance : la souche reste R à l aminoside mais devient S en cas d association aminoside- b é talactamine. La technique de mise en é vidence va utiliser des disques À HAUTE CHARGE provoquant la p é n é tration forc é e de l antibiotique dans la bact é rie.

94 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 94 Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Voici un test réalisé avec 3 aminosides : Streptomycine (S), Kanamycine (K) et Gentamycine (G) Avec : - disques normaux dantibiotiques (charge normale de 15 µg) - disques à haute charge (500 ou 1000 µg) notés HC Il sagit ici dune souche sauvage : elle est R aux aminosides à charge normale et « S » aux aminosides très chargés. S S S HC G HC K HC G G K K

95 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 95 Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas B Il sagit ici dune souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à Haut niveau de R à S - à bas niveau de R à G et K S S S HC G HC K HC G G K K

96 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 96 Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas D Il sagit ici dune souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à haut niveau de R à G et K - à bas niveau de R à S S S S HC G HC K HC G G K K

97 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 97 Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus Cas E Il sagit ici dune souche naturellement R aux aminosides à charge normale et - à haut niveau de R à tous ces aminosides. S S S HC G HC K HC G G K K

98 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Détection des résistances aux antibiotiques Les différentes techniques abordées sont : le test de GOTS le test à la céphalosporine chromogène lobservation de lantibiogramme

99 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 99 Test de GOTS Le test de GOTS permet de rechercher le mécanisme de résistance dune souche à un antibiotique, plus précisément lexistence de synthèse denzyme de destruction ou dinactivation de lantibiotique. Il utilise : - une souche sensible - les souches résistantes à tester - et lantibiotique correspondant pour lequel on recherche la résistance. Les souches testées sont caractérisées par leur capacité de LEVÉE DE LINHIBITION DE LA CULTURE DE LA SOUCHE SENSIBLE.

100 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 100 Test de GOTS : technique Une gélose pour antibiogramme est ensemencée avec la souche sensible, par inondation ou mieux par incorporation. Sur la gélose ensemencée est placé le disque dantibiotique pour lequel la souche est sensible et pour lequel la résistance est recherchée. Chaque souche testée est placée sur la gélose par une strie partant près du disque et se dirigeant vers le bord de la boite. La boite est incubée à 37°C (en général).

101 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 101 Test de GOTS : technique Une fois incubée, voici les résultats obtenus. Constater la présence de culture Constater leffet de lantibiotique sur la souche En toute logique les souches tests doivent cultiver près du disque ! Observer leffet de la souche testée sur la souche sensible : constater une culture paradoxale ici. Dans ce cas, remarquer labsence dinterférence : pas de culture paradoxale ici.

102 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 102 Test de GOTS : exemples Disque dérythromycine. A : témoin positif D : témoin négatif B et C souches essai.

103 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 103 Test Céphalosporine chromogène Le test à la céphalosporine chromogène utilise une céphalosporine couplée à un chromogène. Cette molécule est incolore. Les bactéries sont alors ajoutées à partir dune gélose. Si une bétalactamase est présente dans les bactéries, la céphalosporine chromogène est hydrolysée provoquant lapparition du chromogène libéré rose. ATTENTION : soit lenzyme est CONSTITUTIVE et la bactérie la possède toujours, soit elle est INDUITE et la bactérie doit être pr é lev é e sur un milieu avec inducteur (b é talactamine).

104 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 104 Test Céphalosporine chromogène Un test à la céphalosporine chromogène est commercialisé par biomérieux sous le nom de Cefinase®. Il est imprégné deau puis les bactéries sont déposées à la pipette Pasteur. En voici un résultat (souche dHaemophilus influenzae )

105 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 105 OBSERVATION DE LANTIBIOGRAMME

106 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier AMX(amoxicilline) /AMC (amoxicilline + acide clavulanique)

107 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 107 Observation AM/AMC Lacide clavulanique est une bétalactamine particulière : Il inhibe les bétalactamases (du moins un certain nombre).

108 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 108 Observation AM/AMC Si une souche possède une bétalactamase, elle devient R à lAmpicilline (AM) ou à lAmoxicilline (AMX). Si cette bétalactamase est sensible à lacide clavulanique (AC), et si la bactérie est sensible à AM ou AMX, alors elle devient S à AMC (=AMX + AC). Voici un exemple montrant la Sensibilité à AMC et la Résistance à AM. (souche dHaemophilus influenzae sur gélose Chocolat enrichie) Cette souche montre, dans le test Cefinase,une bétalactamase.

109 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier Colonies « squatters »

110 vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 110 Observation autour dune bétalactamine On peut observer les colonies en limite de zone d'inhibition autour d un disque de bétalactamine : Des colonies débordant légèrement signent la présence probable dune bétalactamase. Colonies « squatters »


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