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1 Grenoble Mardi 13 décembre 2005 Thèse préparée au sein de léquipe de Chimie Biomimétique (L.E.D.S.S.) sous la direction du Pr. Jean-Louis PIERRE et du.

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1 1 Grenoble Mardi 13 décembre 2005 Thèse préparée au sein de léquipe de Chimie Biomimétique (L.E.D.S.S.) sous la direction du Pr. Jean-Louis PIERRE et du Dr. Fabrice THOMAS Association cuivre-radical phénoxyle: chimie en solution et modèles bio-inspirés de la Galactose Oxydase

2 2 Métalloenzymes à cuivre Type I Mononucléaire Transfert délectron Cupro-Protéines Bleues Type II Mononucléaire Activation de O 2 Catalyse réactions redox Galactose Oxydase Type III Dinucléaire Activation de O 2 oxygénation Catéchol Oxydase Autres Polynucléaire Méthane Mono-Oxygénase Ascorbate Oxydase Type Cu A Dinucléaire Transfert délectron Cytochrome - C - Oxydase

3 3 La Galactose Oxydase (GO): une association originale entre un métal et un radical organique

4 4 La Galactose Oxydase (GO) Isolée sous 7 états différents: Structure cristallographique Avec le cuivre Pro GO Apo GO Apo GO oxydée Sans le cuivre Mécanisme catalytique Forme inactive Ar-O-Cu(II) Forme active oxydée Ar-O-Cu(II) Forme active réduite Ar-O-Cu(I) GO native. Maturation Localisation du radical

5 5 Structure cristallographique de la forme inactive Ito N., Phillips S.E.V., Yadav K.D.S., Knowles P.F., J. Mol. Biol., 1994, 238, 794 Lien covalent entre Tyr-272 et Cys-228: rôle important dans la réactivité de la forme radicalaire (forme active oxydée) Cu(II) Tyr-272 Tyr-495 His-581 Acétate N O O S O His-496 N Cys-228

6 6 Caractéristiques UV-Vis et RPE de la forme inactive et active oxydée RPE (30 K, tampon phosphate): système typique dun centre mononucléaire de Cu(II) UV-Vis (298 K, tampon phosphate): bandes de transfert de charge tyrosinate-Cu(II) à 438 nm et transition d-d à 625 nm RPE (30 K, tampon phosphate): silencieuse: couplage anti-ferromagnétique entre le spin du cuivre et du radical UV-Vis (298 K, tampon phosphate): bandes intenses à 445 et 800 nm attribuées aux transitions π - π * du radical Forme inactive Forme active oxydée

7 7 Spectre UV-Vis de la forme inactive et active oxydée Forme inactive: bandes de transfert de charge et transitions d-d Forme active oxydée: transition π - π* du radical tyrosinyle

8 8 Obtention de la forme active oxydée à partir de la pro-GO et de cuivre: Incorporation du cuivre Formation de la liaison covalente entre la Cys-228 et la Tyr-272 Formation du radical tyrosinyle couplé au cuivre Maturation de lenzyme Pro GO Maturation ? Addition de Cu(II) en aérobie: formation lente de la forme active oxydée (t 1/2 réaction = 5 h) Addition de Cu(I) en aérobie: formation rapide de la forme active oxydée (t 1/2 réaction = 4 s) M.M.Whittaker and J.W.Whittaker J. Biol. Chem., 2003, 278, Forme active oxydée

9 9 Modèles biomimétiques - Manipulation plus aisée que lenzyme - Relation structure moléculaire/ propriétés spectroscopiques (modèles structuraux) - Reproduire la réactivité (modèles fonctionnels) Modèles bio-inspirés - Connaître lobjet de « base » - Inspiration - Entité nouvelle avec des propriétés structurales et fonctionnelles inédites Modélisation du site actif de métalloenzymes

10 10 Les complexes dérivés de ligands tripodaux de type N 3 O Les complexes dérivés de ligands tripodaux de type N 2 O 2 Les complexes salen Les complexes dérivés de triazacyclononanes (TACN) Modélisation du site actif de la Galactose Oxydase

11 11 Modélisation du site actif par les complexes synthétiques: Modèles tripodaux de type N 3 O et N 2 O 2 modèles tripodaux de type N 2 O 2 modèles tripodaux de type N 3 O S = solvant ou contre-ion

12 12 Rajendra U., Viswanathan R., Palaniandavar M., Laksminarayanan M., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1992, Modélisation de la tyrosine axiale et des propriétés spectroscopiques de la forme inactive Modèles biomimétiques de type N 3 O

13 13 Thomas F, Gellon G., Gautier-Luneau I., Saint-Aman E., Pierre J. L., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 114, 3173 Premier modèle à la fois structural du site actif de la forme inactive et fonctionnel de la forme oxydée Modèles biomimétiques de type N 2 O 2

14 14 Modèles bio-inspirés de type TACN et salen TACN: le cuivre(II) est dans un environnement pyramide à base carrée avec les phénolates systématiquement en position équatoriale Salen: le cuivre(II) est dans un environnement plan carré distordu vers le tétraédre Bill E., Müller J., Weyhermüller T., Wieghardt K., Inorg. Chem., 1999, 38, Thomas F., Jarjayes O., Duboc C., Philouze C., Saint-Aman E., Pierre J. L., Dalton Trans., 2004, Deux premiers systèmes bis (radical phénoxyle)-Cu(II):

15 15 Nos objectifs - Choix structuraux - Préparation des complexes radicalaires par voie électrochimique - Sélectionner le ou les ligands conduisant à des complexes radicalaires stables Approche biomimétique de la maturation de la GO Etendre cette association à des systèmes inédits bio-inspirés emmagasinant 3 et 4 équivalents oxydants Association radical phénoxyle-Cu(II)

16 16 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES (VOIE CLASSIQUE) Choix du type de ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires Les complexes radicalaires les plus stables 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en présence dune base La RMN 19 F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants 4- CONCLUSION ET PERPECTIVES PLAN

17 17 Choix structuraux: ligands tripodaux de type N 3 O - Modifier la structure du ligand et les propriétés électroniques du phénol - Oxydation centrée sur le phénol - OMe - tBu - OMe - tBu - F - CF 3 - NO 2 - Benzimidazole - Benzimidazolium -6 méthylpyridine -6 fluoroquinoléine -bras méthylpyridine -bras éthylpyridine - Z = H - Z = D Synthèse de 14 ligands

18 18 Exemples de ligands synthétisés Modifications des substituants sur le phénol: Modifications autres que sur le phénol:

19 19 Structures des complexes du Cu(II) synthétisés La structure du complexe dépend du substituant en ortho du phénol: Obtention de 28 complexes du Cu(II) Substituant méthoxyle: Complexe monomère [LCu] Substituant tertiobutyle: Sel de Cu(II) Complexe dimère [L 2 Cu 2 ] Complexe phénolate [LCu] Complexe phénol [HLCu] sans Et 3 Navec Et 3 N

20 20 Caractérisation des complexes monomères par diffraction des RX 2,15 Å 2,51 Å

21 21 Cas de la quinoléine fluorée: Complexe phénol: arrangement « classique » Complexe phénolate: loxygène phénolique est en position équatoriale ; lazote de la quinoléine est en position apicale 1,90 Å

22 22 Environnement de type pyramide à base carrée relativement distordue, avec les oxygènes phénoliques en position axiale Caractérisation des complexes dimères par diffraction des RX

23 23 Caractérisation par spectroscopie RPE en solution gelée (100 K) Complexes monomères Complexes dimères - Transitions Ms = ± 1 avec structure hyperfine due au couplage du spin électronique avec le noyau du cuivre (I = 3/2): 4 raies - Transitions Ms = ± 1 - Transitions interdites Ms = ± 2

24 24 Caractérisation par spectroscopie UV-Vis en solution (298 K) - Complexe phénol Ar-OH---Cu: transition d-d ( nm) - Complexe phénolate Ar-O---Cu: bandes de transfert de charge phénolate-Cu(II) ( nm) et transition d-d

25 25 Comportement électrochimique: voltammétrie cyclique Complexes phénols Ar-OH---Cu Oxydation irréversible à deux électrons centrée sur le phénol: phénol phénoxonium EpaEpa Complexes phénolates Ar-O---Cu Oxydation réversible ou irréversible à un électron centrée sur le phénolate: Ar-O---Cu Ar-O ----Cu phénolate phénoxyle EpaEpa EpcEpc phénoxyle phénolate.+.+

26 26 Présence de substituants électro-attracteurs sur le phénolate (NO 2, benzimidazole, CF 3, F): - diminution de la réversibilité du système - augmentation considérable du potentiel doxydation Comportement électrochimique des complexes phénolates Présence de substituants électro-donneurs sur le phénolate (OMe, tBu): - systèmes réversibles - potentiels doxydation faibles Corrélation linéaire entre le potentiel doxydation E p a des complexes et p + de Hammett :

27 27 Complexes radical phénoxyle-Cu(II) Obtention: électro-oxydation au potentiel E p a des complexes phénolates monomères ou dimères à -40°C, sous gaz inerte Complexes monomères radicalaires: Caractérisation des complexes radicalaires: Spectroscopie UV-Vis Spectroscopie RPE Stabilité (temps de demi-vie)

28 28 Caractérisation par spectroscopie UV-Vis et RPE Présence de bandes absorption intenses vers 400 nm et 700 nm attribuées aux transitions π–π* du radical phénoxyle Spectroscopie UV-Vis (243 K) Couplage ferromagnétique entre le spin du radical et celui du cuivre (S = 1): transitions interdites Ms = ± 2 Spectroscopie RPE (4 K)

29 29 Z = D Limite la dégradation par couplage radicalaire Stabilisation par des substituants électro-donneurs Stabilisation par des substituants encombrants Peu dinfluence sur la stabilisation Stabilité des complexes radicalaires Temps de demi-vie de 0,7 min à 230 min à 25°C t 1/2 = 230 min à 25°Ct 1/2 = 120 min à 25°C Bonne réactivité vis-à-vis de loxydation dalcool primaire

30 30 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES Choix du ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en solution en présence de base La RMN 19 F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants PLAN

31 31 Expériences réalisées: Addition de Cu(I) au ligand, puis exposition à lair Addition de Cu(II) au ligand sans base (aérobie) Addition de Cu(II) au ligand avec base (aérobie ou anaérobie) suivi par spectroscopie UV-Vis Maturation Forme active oxydée Pro-GO Modélisation de la maturation de lenzyme Cuivre / O 2 ? ligand Complexe radicalaire

32 32 Addition progressive de Cu(II) au ligand en présence de triéthylamine Première étape: de 0 à 1 équivalent de Cu(II) ajouté / ligand (- 40°C, CH 3 CN) Apparition des bandes de transfert de charge du complexe phénolate

33 33 Addition de Cu(II) en présence de triéthylamine Deuxième étape: de 1 à 2 équivalents de Cu(II) ajouté / ligand (- 40°C, CH 3 CN) Disparition des bandes de transfert de charge du complexe phénolate Apparition de bandes très intenses vers 400 nm attribuées aux transitions π-π* du radical phénoxyle Rôle oxydant du métal + Cu(II)+ Cu(I) Comportement observé pour tous les ligands ayant conduit à des complexes radicalaires stables par oxydation électrochimique

34 34 CH 3 CN 1 Cu 2+ 1 Et 3 N 1 Cu 2+ CH 3 CN Complexe phénolate 1 Cu 2+ CH 3 CN 1 Cu 2+ CH 3 CN Complexe phénol SANS Et 3 N

35 35 Optimisation du modèle: introduction dune base endogène - Stabilise les radicaux phénoxyles sans le métal - En para : éviter dinterférer avec la complexation - Eviter la formation de dimère - Stabiliser le radical Choix du ligand: État de protonation: RMN 2D (DMSO): Séquences GHMQC et GHMBC

36 36 Addition de Cu(II) 1 Cu (II) (- 40°C, CH 3 CN) Complexe électro-généré

37 37 Comparaison Enzyme / Modèle -2 H + -2 e - + Cu(I) + Cu(II) 1 O 2 1 Et 3 N / Benzimidazole 1 Cu(II) - 1 H e - Base Oxydant Base Oxydant H2O2H2O2

38 38 La RMN 19 F: un outil original et efficace pour létude en solution de complexes paramagnétiques de cuivre Marquages utilisés: Détermination dune constante de vitesse déchange entre un complexe phénol et de son homologue phénolate par une expérience en température variable Formation du radical phénoxyle par ajout de Cu(II) à basse température

39 39 Mis en évidence de léquilibre rapide entre les complexes phénol et phénolate dans CD 3 CN (Réf: C 6 F 6 ) 10 ppm = 53,7 ppm 10 ppm = 51,3 ppm Mélange équimolaire Equilibre proche de la coalescence à 25°C 10 ppm = 49,0 ppm 100

40 40 10 ppm = 51,3 ppm Déterminer la constante de vitesse k par une expérience en température variable sur un mélange équimolaire des deux complexes dans CD 3 CN/CH 3 CH 2 CN (1/2): k k -1 ++

41 41 Coalescence à T c = -47°C k c = π. / 2 1/2 k à -47°C = 3135 s -1 Détermination de la constante de vitesse ppm °C -8°C -21°C -33°C -44°C -46°C -49°C -59°C -65°C -72°C = 49,0 = 53,7 Température = 51,3

42 42 Transfert du proton couplé au réarrangement quinoléine axiale / quinoléine équatoriale Interprétation Complexe phénol Complexe phénolate k k -1

43 43 Formation in situ du radical phénoxyle Addition Cu(II) sur le complexe phénolate et enregistrement de spectres en fonction du nombre déquivalents de cuivre ajouté

44 44 ppm = 49,0 = 53,7 eq Cu(II) Formation in situ du radical phénoxyle (CD 3 CN ; -35°C) Cu(II)Cu(I)

45 45 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES Choix du ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en présence de base La RMN 19 F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO-INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants PLAN

46 46 Les différentes possibilités Emmagasiner trois équivalents oxydants: 2 possibilités ?

47 47 Choix structuraux: un ligand dérivé des modèles tripodaux N 3 O Ligand L dinucléant maintenu par un lien: - Maintient de la structure par le phénol commun - Groupement OMe électrodonneurs stabilisant - Deux sites de complexation identiques de type N 3 O

48 48 Synthèses et caractérisations des complexes (CH 3 CN) L 2 Cu 2+ CH 3 CN 1 eq Et 3 N 2 Cu 2+ CH 3 CN 2 eq Et 3 N -Bandes de transfert de charge -phénolate-Cu(II) -Transitions d-d -Bandes de transfert de charge -phénolate-Cu(II) -Transitions d-d S tot = 1S tot = 0 -phénolate -phénoxyle EpaEpa EpaEpa EpcEpc EpcEpc

49 49 Caractéristiques UV-Vis et RPE des complexes oxydés à 1 électron Transitions π-π* S tot = 3/2 fondamental M s = ± 3

50 50 Électro-oxydation t 1/2 = 22 min à 25°C t 1/2 < 20 secondes à 17°C

51 51 Préparation des complexes biomimétiques radical phénoxyle-Cu(II): Voie classique: oxydation électrochimiques des complexes phénolates t 1/2 = 120 min à 25°C Influence prépondérante de R 1 et R 2 sur la stabilité des complexes radicalaires: STABILISATION par des substituants encombrants (ortho) et électrodonneurs (para) Conclusion générale La Galactose Oxydase:

52 52 Modèle, a posteriori bio-inspiré, de la maturation de lenzyme Modélisation de la maturation de la GO: complexation Oxydation

53 53 Extension à des modèles bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants S = 3/2 fondamental

54 54 Greffage des ligands sur support solide Pourquoi un deuxième équivalent de Cu(II) est-il nécessaire? Réactivité des complexes emmagasinant trois équivalents oxydants Perspectives

55 55 Remerciements Pr. Jean-Louis PIERRE Dr. Fabrice THOMAS Dr. Sylvain HAMMAN Dr. Catherine BELLE …

56 56 stop 0 + -

57 57 Formation du lien covalent (Cu I )

58 58 Formation du radical (Cu I )

59 59 Formation du lien covalent et radical (Cu II )

60 60 N 3 O: réaction lente avec O 2 : antidismutation avec L N2O2 + Cu II 0,5 LCu II + 0,5 Cu I + 0,5 L. L N3O + Cu II LCu ? LCu II LCu II + Cu I. ? Cu II Cu I + L N 2 O 2 : réaction très rapide avec O 2 LCu II. 0,5 LCu II. LCu I OK

61 61

62 62

63 63 Potentiels V vs Fc + /Fc E o O2/H2O = 0,60 (eau) E o O2/H2O2 = 0,03 (eau) E CuII/CuI = ~ 0,80 (acétonitrile) 0,15 < E Complexe radicalaire/Complexe phénoate < 0,83 (acétonitrile) E LCuI/LCuII = - 0,50 (acétonitrile) E o GOox/GOinac = - 0,20 (eau) E o GOinac/GOred = - 0,40 (eau)

64 64 Pro-séquence N-terminale: A V G T G I P E G S L Q F L S L R

65 65

66 66

67 67 Glyoxale Oxydase RCHO + H 2 O + O 2 RCO 2 H + H 2 O 2


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