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Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe despèces chêne sessile – chêne pédonculé Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO.

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1 Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe despèces chêne sessile – chêne pédonculé Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine Site de Recherche de Pierroton CESTAS Présentation des travaux de thèse Vendredi 10 Avril 2009 LRBB Co-directeurs: Pauline Garnier-Géré Antoine Kremer Septembre 2007 – Août 2010

2 Plan de lexposé I. Présentation du sujet – Problématique Spéciation sympatrique et flux de gènes Le complexe despèces chêne sessile – chêne pédonculé Des divergences phénotypiques Une faible divergence moléculaire II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Objectif et principe Le dispositif Réalisation des croisements Mesures cytologiques Résultats Perspectives III. A la recherche des gènes de spéciation Objectif Choix des GC Résultats Le cas du locus S Perspectives

3 Plan de lexposé I.Présentation du sujet – Problématique

4 Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept despèce biologique basé sur lisolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique I. Présentation du sujet – Problématique (en rouge: barrières reproductives)

5 Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept despèce biologique basé sur lisolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique I. Présentation du sujet – Problématique (en rouge: barrières reproductives) Interaction entre flux de gènes et divergence

6 Spéciation sympatrique et flux de gènes Différents types de barrières à lhybridation: I. Présentation du sujet – Problématique From Lepais 2008 (PhD)

7 Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours dune spéciation sympatrique? Modèle dun génome en « mosaïque » proposé par Wu : I. Présentation du sujet – Problématique spéciation Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusquà divergence totale des génomes

8 Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours dune spéciation sympatrique? Modèle dun génome en « mosaïque » proposé par Wu : I. Présentation du sujet – Problématique spéciation Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusquà divergence totale des génomes Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives

9 Spéciation sympatrique et flux de gènes I. Présentation du sujet – Problématique Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives Quelques résultats en accord avec ce modèle: Nosil & al., 2009Savolainen & al., 2009

10 Spéciation sympatrique et flux de gènes I. Présentation du sujet – Problématique - Etude de linteraction entre les flux de gènes et la sélection divergente - Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ? Modèle détude: le complexe despèces chêne sessile – chêne pédonculé

11 Le complexe despèces chêne sessile – chêne pédonculé I. Présentation du sujet – Problématique Chêne sessile (Quercus petraea) et chêne pédonculé (Quercus robur) Aire de répartition sympatrique: Potentiel « hotspot » dhybridation Atlas Florae Europaeae 1999

12 Hybridation asymétrique: sessile (pollen) pédonculé Bacilieri & al., 1996: Analyses de parenté Kleinschmit & al., 2000: Croisements contrôlés Expérience de Guy Roussel à lINRA A la base dun modèle de migration: Un modèle de migration despèces : Q. robur = espèce pionnière : Q. petreae = espèce en introgression of sessile From Lepais 2008 (PhD) Petit & al 2004

13 Des divergences interspécifiques Divergences morphologiques Divergences écologiques Types de sols SessilePédonculé Wet Dry pH Kremer et al From Lepais (PhD) I. Présentation du sujet – Problématique Rameau & al. 1994

14 Une différenciation moléculaire très faible… Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » I. Présentation du sujet – Problématique

15 Une différenciation moléculaire très faible… Toutefois, forte différenciation pour quelques marqueurs Scotti-Saintagne et al., 2004 Ces marqueurs ont été cartographiés Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » I. Présentation du sujet – Problématique

16 …mais des « hotspots » de différenciation Scotti-Saintagne et al., 2004 Cartographie des marqueurs: Existence de régions génomiques (~15cM) plus différenciées entre les deux espèces En accord avec la vision génique de la spéciation proposant un modèle de génome en mosaïque structuré en régions différenciées et perméables aux flux de gènes, dans le cadre dun processus de spéciation sympatrique I. Présentation du sujet – Problématique

17 …mais des « hotspots » de différenciation I. Présentation du sujet – Problématique Limites des données actuelles: Etudes anciennes avec marqueurs peu informatifs Peu de données sur les fonctions des gènes dans les clusters différenciés Au final, peu de données biologiques précises sur la compatibilité de lhybridation A quel niveau se situe ce complexe despèces dans le modèle de Wu ?

18 Stratégie de recherche Objectif général: Mieux comprendre linteraction entre flux de gènes et sélection divergente Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique I. Présentation du sujet – Problématique

19 Stratégie de recherche I. Présentation du sujet – Problématique Objectif général: Mieux comprendre linteraction entre flux de gènes et sélection divergente Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique 2 approches parallèles: - Croisements contrôlés inter-spécifiques Etude de la compatibilité dhybridation entre différents génotypes - Recherche des gènes de « spéciation » impliqués dans la divergence Approche gènes candidats Etude de la diversité moléculaire et de la différenciation

20 II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

21 Objectif et principe des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Objectif : Etudier la compatibilité dhybridation entre les deux espèces Principe : Caractérisation de croisements hybrides en fonction de différents génotypes Croisements dans le sens le plus favorable: sessile vers pédonculé

22 Le dispositif II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Parcelle expérimentale de lINRA à Bourran (Lot-et-Garonne) 2196 individus pédonculés âgés de 7 à 10 ans Arbres « plein-frères »: Descendants F1 du croisement intra-pédonculé 3P x A4 352 génotypes, présents de 7 à 10 copies (clones) Nombreuses données disponibles sur ces arbres (taille, croissance, débourrement, etc)

23 Les arbres du croisement II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 30 arbres mères pédonculés 10 génotypes représentatifs de la variabilité du pédigrée 3 clones par génotypes Mélange pollinique sessile 4 individus sessiles en proportion 25% de grains viables (Qs27, Qs30, Qs31, Qs32)

24 Les arbres du croisement II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Localisation des arbres sur la parcelle

25 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Protocole mis au point à lINRA par Guy Roussel

26 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Lempochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant

27 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Lempochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant

28 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique

29 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique

30 Les étapes des croisements II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Dépochage, mesures, prélèvements De Mai à Septembre

31 Mesures cytologiques II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Objectif : Observation des tubes polliniques en croissance dans les styles Protocole fourni par Adrienne Ressayre Basé sur une coloration au bleu daniline (callose) Microscopie à fluorescence (UV) Prélèvements et conservation dans le FAA

32 Croisements contrôlés : Variables mesurées II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Identification Morphologie Phénologie Succès des croisements Cytologie

33 Croisements contrôlés : Analyses de variance II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 4 modèles danalyse de variance utilisés: « Effet génotype seul » Yij = µ + Gi + Eij Valeur moyenne effet génotype erreur « Effet génotype + bloc » Yij = µ + Gi + Bj + Eijk Valeur moyenne effet génotype effet bloc erreur « Analyse de covariance » Yik = µ + Gi + β COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur « Analyse de covariance hiérarchisée » Yik = µ + Gi + β i COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur : Effet génotype : Effet environnement

34 Croisements contrôlés : Analyses de variance II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Effet génotype significatif

35 Croisements contrôlés : Analyses de variance II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Nécessité de déclarer des covariables représentant les hétérogénéités de lenvironnement pour mettre en évidence les effets génotypes Augmentation de la puissance des tests

36 Croisements contrôlés : Analyses de variance II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Contribution des effets sur la somme des carrés décarts totaux sur la moyenne finale

37 Croisements contrôlés : Résultats

38 Comparaison avec les témoins naturels II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Plus dinflorescences pour les arbres empochés Influence de la poche qui favoriserait la floraison? Plus de grains de pollen sur les fleurs pour les témoins naturels Plus longue exposition au pollen chez les témoins?

39 Comparaison avec les témoins naturels II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Pour la même date de prélèvement, les tubes polliniques sont plus développés chez les témoins naturels Ralentissement de la croissance des tubes Existence de barrière pré-zygotique ?

40 Corrélations entre variables II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Relations positives, artificiellement créées ? Manque de points intermédiaires A confirmer en 2009 Augmentation des mesures Pas de conclusions possibles à ce stade (116) (140)

41 Et côté paternel ? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Génotypage des glands obtenus pour déterminer le père de chaque gland 336 glands génotypés avec 12 microsatellites Pas de résultats à présenter aujourdhui (il manque un parent) Type de résultats attendus: Objectif : Données sur de possibles différences de compatibilité selon le génotype de chêne sessile

42 Croisements contrôlés : Conclusions II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Différences significatives entre les génotypes darbres mères pour les variables mesurées Différences entre les génotypes pour la compatibilité dhybridation Moins bonne croissance des tubes polliniques lors des croisements hybrides Détection de barrières pré-zygotiques A confirmer: corrélations entre variables cytologiques et « macrovariables » Détection de barrières pré-zygotiques ?

43 Croisements contrôlés : en 2009 II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Génotypage des glands Suivi des glands Données sur barrières post-zygotiques? Les croisements et les mesures cytologiques réalisés en 2008 ont bien fonctionné et nous ont apporté des infos Nouveaux croisements 2009 à plus grande échelle: Augmentation du nombre de croisements hybrides 19 génotypes * 3 clones 2 génotypes « ponts » Croisements intra-pédonculés Témoins empochés 10 génotypes * 1 clone Croisements intra-pédonculés Suivi de témoins naturels 19 génotypes * 3 clones Pollen sessilePollen pédonculéPollen naturel

44 Croisements contrôlés : en 2009 II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Suivi de 124 arbres, dont 66 empochés la semaine dernière : Merci à Guy, Benjamin, et à lUnité Expérimentale de Bourran

45 Plan de lexposé II.A la recherche des gènes de spéciation Analyse de séquences nucléotidiques de gènes candidats

46 A la recherche des gènes de spéciation Objectif : Détection de gènes candidats potentiellement impliqués dans la divergence entre les deux espèces Principe : Analyse de séquences nucléotidiques : diversité et différenciation inter-spécifique Focalisation sur les gènes potentiellement impliqués dans les barrières à lhybridation Détection de gènes « outliers » par rapport à une référence expérimentale « neutre » basée sur létude dun grand nombre de fragments (projet de reséquençage) III. A la recherche des gènes de spéciation

47 Choix des gènes candidats III. A la recherche des gènes de spéciation MECHANISME GENERAL FONCTIONSTRATEGIE NOMBRE DEST SELECTIONNE OK / TESTED Interspecific incompatibility -pollen/pistil interaction -pollen germination -pollen tube growth -pollen tube guidance -Keywords search in Arabidopsis, Populus and Prunus databases -Blast against own oak EST database 383 / 5 Flowering -phase transition -flowering 90 / 0 Strong Gst -pollen cytosqueletton -pollen glycoproteins -pollen-specific proteins -Oak genome scanning for strong Gst ESTs -Selection by function annotation 112 / 5 Auto- incompatibility -S locus proteins -Direct design of degenerated primers according to Prunus sequences alignements 20 / 2

48 Fragments séquencés III. A la recherche des gènes de spéciation Gene Pop2: Précurseur dune sous-unité de la gamma-aminobutyrate transaminase Contrôle du guidage du tube pollinique Longueur du gène chez At = 5,3kb, 13 introns 1 fragment obtenu sur 13 testés Gene Tub8: Sous unité alpha de la tubuline 8 Longueur du gène chez At = 1,8kb 2 fragments obtenus sur 4 testés Gene H8: Récepteur glycoprotéique Screené avec un fort Gst dans la banque 2 fragments obtenus sur 2 testés

49 Fragments séquencés III. A la recherche des gènes de spéciation Gene Feronia: Récepteur à activité kinase exprimé dans les synergides Contrôle de linteraction pollen-pistil chez At 3 paralogues détectés chez le chêne, 1 séquencé 1 fragment obtenu sur 4 testés Gene ROS: Récepteur exprimé dans le pollen Screené avec fort Gst dans la banque 1 fragment obtenu sur 1 testé

50 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation

51 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation Calcul des statistiques Fst / Nst par une AMOVA sur des matrices de distance entre les haplotypes D de Tajima Fs de Fu Reconstitution des phases avec Arlequin Algorithme ELB (Excoffier & al., 2003) POP2 : p>0,8 pour 10 individus sur 19 TUB8 : p>0,8 pour 9 individus sur 22 H8 : p>0,8 pour 8 individus sur 16 Feronia : p>0,8 pour 9 individus sur 14 ROS : p>0,8 pour 11 individus sur 14

52 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation

53 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation Nst (2) 13,5% 10,1% 14% -0.04% 12% Nst (2): Autre méthode dans Arlequin pour estimer le Nst « Locus by locus Amova » Se base sur le calcul du Fst à chaque SNP Avantage: ne dépend pas de la phase, et moins dépendant des données manquantes

54 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation *** Ecarts entre Fst et Nst

55 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation *** Forte différenciation des locus POP2 et H8

56 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation *** Forte diversité des locus POP2 et ROS

57 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation *** D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia

58 Interprétation des tests III. A la recherche des gènes de spéciation D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia Fs de Fu < 0 pour les 5 gènes Θ s : estimateur de diversité basé sur le nombre de sites polymorphes Θπ : estimateur de diversité basé sur le nombre moyen de différences entre séquences Sous hypothèse de neutralité sélective et déquilibre démographique, tous les estimateurs de diversité sont égaux à 4 Ne µ Ici, un D < 0 correspond à un excès de mutations rares ( θ s y est + sensible que θ π) Sinterprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique (ERREUR DANS LE RAPPORT) avec K = nbre dhaplotypes attendu k obs = haplotypes observés Si k obs > K = excès dallèles en faible fréquence S est faible Fs < 0 Sinterprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique

59 Analyse le long des fragments III. A la recherche des gènes de spéciation A faire : estimer les taux de recombinaisons et les DL

60 Analyse le long des fragments Gène Tub8 Gène entier 1,8kb Intron de 100pb connu comme très différencié (Porth & al, soumis)

61 Analyse le long des fragments Intron de 100pb connu comme très différencié (Ilga Porth, comm. perso.) Gène entier 1,8kb Baisse de la diversité et de la différenciation de 5 vers 3 Gène Tub8 zone en 5 différenciée zone fonctionnelle soumise à sélection purificatrice?

62 Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation Létude de ces gènes candidats révèle des patterns de diversité et de différenciation intéressants: Diversité importante pour les gènes POP2 et ROS Forte différenciation des gènes POP2, H8 et TUB8 (10 à 16%) D de Tajima < 0 pour TUB8 et FERONIA Ce sont des gènes homologues de gènes impliqués dans les barrières aux croisements Bons candidats de gènes de « spéciation » Est-ce que ce sont des « outliers » ?

63 Recherche d« outliers » simulations réalisées avec le logiciel FDIST2 (M. Beaumont) Détermination des quantiles 5% et 95% correspondant aux enveloppes inférieures et supérieures de la distribution des points Quantile 95% Median Quantile 5% Hétérozygotie Paramètres des simulations: 2 populations 2 dèmes Fst = 3% simulations Fst III. A la recherche des gènes de spéciation

64 Recherche d« outliers » Fst Fst des 5 gènes H des 5 gènes Pas de gène outlier détecté avec ces simulations Recherche de SNP outliers Réalisation des simulations avec dautres logiciels (SIMCOAL) (méthodes ABC) Recherche doutliers avec le Nst et non le Fst Hétérozygotie III. A la recherche des gènes de spéciation

65 Le locus S dauto-incompatibilité III. A la recherche des gènes de spéciation Système gamétophytique à deux composantes ( S-RNase et SFB) Individus 100% hétérozygotes Association dallèles des 2 gènes S-RNase et SFB Quest-ce qui se passe au niveau inter-espèces pour la différenciation génétique ? Mécanisme favorisant les croisements entre individus différents Favorise lhybridation ? Acquisition de données en 2009, nécessiter de passer par des étapes de clonage

66 Perspectives III. A la recherche des gènes de spéciation Obtention de données sur un plus grand nombre de gènes candidats Résultats du projet de reséquençage allélique (2009) Obtention de statistiques sur 300 ESTs aléatoires A utiliser comme référence neutre pour la recherche doutliers Augmentation du nombre dindividus séquencés pour les gènes qui seront les plus intéressants

67 Perspectives Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ? Fst et Nst = indices de fixation Creuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs / partagés) ?

68 Aparté sur les types de polymorphismes GèneHaplotypes exclusifsHaplotypes partagés Pop2321 Tub8371 H8163 Feronia230 ROS250 (basés sur les reconstitutions de phase dArlequin) Calcul dautres paramètres pour estimer la différenciation ? Dst = absolute differentiation (Nei 1973) Gst = relative differentiation (Nei 1973) Hst = between-subpopulation heterozygosity (Aczel & Daroczy 1975; Tsallis & Brigatti 2004) Δ st = between-subpopulation component of diversity, or the effective number of distinct subpopulations (Jost 2008) D = actual differentiation (Jost 2008) This is NOT the same thing as Dest. Hs/Ht = proportion intra-population heterozygosity vs total heterozygosity (Jost 2008) Δ s/ Δ t = proportion of total diversity that is contained in the average subpopulation (Jost 2008) Jost 2008

69 Perspectives Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ? Fst et Nst = indices de fixation Creuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs / partagés) ? Développer une recherche doutliers basée sur le Nst ou autre ? Test de type Beaumont & Nichols Réalisation dune routine permettant de simuler des enveloppes neutres et de placer des gènes / SNPs par rapport à ces enveloppes, à partir dentrées fasta par exemple. Utilisation de R ou de SIMCOAL Tester le sens des flux de gènes dans ce complexe despèces ? Méthode développée par M. Navascues (ENS Ulm), basée sur les types de polymorphismes Où se situe ce complexe despèces dans le processus de spéciation ? Un équilibre entre flux de gènes et sélection divergente est-il possible ? Modélisation des données dans un modèle de spéciation sympatrique Gavrilets & al., 2007

70 Merci de votre attention


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