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Nathalie Parthuisot 2006 - 2009 Caractérisation et quantification des populations de Légionelles naturellement présentes dans la rivière « Le Tech » École.

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1 Nathalie Parthuisot Caractérisation et quantification des populations de Légionelles naturellement présentes dans la rivière « Le Tech » École Doctorale de Biochimie et Biologie Moléculaire B2M Université Paris Diderot-Paris 7 Université Pierre et Marie Curie-Paris 6

2 Maladie infectieuse bactérienne, connue depuis lépidémie de La Légionellose Les Légionelles Les épidémies en constante progression Deux manifestations cliniques : fièvre de Pontiac / infection pulmonaire grave Ces infections sont graves Cest un bacille Gram-, aérobie, flagelle monopolaire, mesure 0.5µm (largeur) et 2µm (longueur ) 49 espèces décrites. Legionella pneumophila est la plus virulente pour lhomme (plus de 80% des cas déclarés) Introduction

3 Légionelles : bactéries ubiquitaires de lenvironnement, qui se développent dans : La contamination à lhomme : inhalation d'aérosols contaminés eaux douces : les rivières, torrents et lacs eaux marines et des sols mouillés ou humides. Les milieux aquatiques artificiels : réseaux deau chaude (hôpitaux, hôtels, immeubles) les systèmes de climatisation, thermes, spa (…) mauvais entretien du réseau deau Cependant, on ne connait pas les sources et les réservoirs naturels environnementaux des Légionelles. Sources et réservoirs Les milieux aquatiques naturels :

4 Paramètres physico chimiques Multiplication (Abu Kwaik 1998) Rescucitation (Garcia 2007) Inhibition (Temmerman 2007) Multiplication (Yammoto 1992) Protection, Nutrition (Murga 2001, Storey 2004) Interactions facteurs environnementaux Facteurs biotiques : pH Température Protozoaires Flore associée Biofilm

5 Etats physiologiques : Quels facteurs permettent aux Légionelles de se multiplier ? Devenir : Comment acquièrent-elles leur virulence ? Et comment évaluer le risque sanitaire ? Interactions facteurs environnementaux Quels facteurs induisent ces états et quelle est loccurrence des Légionelles VNC en milieu naturel ? Les Légionelles sont elles capables dévoluer vers des états Viables Non Cultivables (VNC) ? Quels facteurs de stress entrainent la survie des Légionelles ?

6 Ecologie des légionelles Rivières, torrents, lacs Interactions facteurs environnementaux : Ecologie complexe Paramètres physico chimiques Flore associée Sources / Réservoirs : Milieux aquatiques naturels, Milieux aquatiques artificiels Etats physiologiques : Multiplication Survie Viables Non Cultivables Evolution dans réservoirs : Virulence Risque sanitaire Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Thèse :

7 Présentation site détude : Le Tech Sources principales de contamination / stations analysées Dynamique des Légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » 1.Identification des sources et des réservoirs environnementaux

8 Fleuve côtier, extrémité sud des Pyrénées-Orientales. Ecoulement sur 85.7 km, bassin versant de 780 km2 Source : massif du Costabonne (2345 m) Le Tech (1)

9 Réalisation de la carte : année 2000 Le Tech (2)

10 Suivis mensuels et saisonniers, des 9 stations : 2.Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Influence des paramètres environnementaux Analyse de la diversité spécifique des Légionelles Quantification des L. pneumophila totales, Quantification des L. pneumophila actives et Quantification des L. pneumophila cultivables Occurrence in situ des formes VNC

11 Développements méthodologiques (eaux et sédiments) : Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Méthodes de détection : Culture (norme AFNOR) PCR Immunofluorescence Optimisation double-marquage L. pneumophila actives : Couplage spécificité (anticorps monoclonal) et activité métabolique Cytométrie phase solide Sédiments : application au préalable dun gradient de séparation Méthode alternative de quantification des L. pneumophila actives

12 Marquages immunofluorescents de L. pneumophila actives L. pneumophila cells immunostained Active L. pneumophila cell L. pneumophila cells immunostained Active L. pneumophila cell

13 Validation protocole de double-marquage Principe : Eau robinet, dopée de à Lp/litre Paramètres mesurés : L. pneumophila totales, actives et cultivables Résultats :

14 Suivis mensuels : premiers résultats La PresteCéret L. pneumophila totales L. pneumophila actives Résultats préliminaires

15 Développements méthodologiques (eaux et sédiments) : Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Analyses des dynamiques des espèces de Légionelles : Méthodes de détection classique : L. pneumophila et quelques Legionella spp Manque dinformation sur dynamique intra-spécifique Optimisation outil dempreintes moléculaires : CE-SSCP variations spatio-temporelles des espèces variations des espèces en fonction des stations Outil de quantification moléculaire (PCRq en temps réel) : Suivre variations Legionella spp et L. pneumophila

16 Conclusion Résultats préliminaires : Concentrations L. pneumophila totales (vivantes et mortes) non négligeables Concentrations faibles en L. pneumophila actives : 0.02 à 1% L. pneumophila totales Quantifications de L. pneumophila viables non cultivables Outils pertinants pour étudier dynamique des Légionelles Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » Perspectives : Dynamiques saisonnières et stations-dépendantes Influence des facteurs environnementaux


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