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1 Croissance et reproduction bactériennes. Définitions Croissance = accroissement ordonné de tous les composants dun organisme Reproduction = fabrication.

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1 1 Croissance et reproduction bactériennes

2 Définitions Croissance = accroissement ordonné de tous les composants dun organisme Reproduction = fabrication dun nouvel individu - par union de gamètes (reproduction sexuée) - par mécanisme asexué Remarque : pour une bactérie, la croissance est toujours suivie de la reproduction asexuée

3 Plan 1- Mécanisme et caractéristiques de la croissance et de la reproduction dune bactérie 2- Etude expérimentale de la croissance dune population bactérienne 3

4 4 1- Mécanisme et caractéristiques de la croissance et reproduction dune bactérie

5 1-1- Mécanismes de la croissance et de la reproduction

6 Croissance -Réplication du DNA (de lADN) ce qui conduit à la présence temporaire de 2 molécules de DNA dans le cytoplasme -Synthèse de paroi, de membrane plasmique : allongement de la bactérie -Synthèse de constituants cytoplasmiques 6

7 Reproduction asexuée par scissiparité 7

8 La multiplication (division) bactérienne

9 La reproduction asexuée la scissiparité Mécanisme : L'unique molécule dADN circulaire se réplique (se double), de nouvelles molécules de la paroi et de la membrane plasmique sont synthétisées et les constituants cytoplasmiques voient leur stock doublé. La bactérie s'allonge et se divise en deux par suite dune invagination de la membrane plasmique et de la paroi formant un septum avec répartition des constituants dans chacune des bactéries filles. Séparation des 2 bactéries filles Conséquences : Mode de reproduction qui n'introduit pas de variabilité génétique chez les bactéries filles qui sont identiques entre elles et identiques à la bactérie initiale Celles-ci forment des « clones » : des bactéries génétiquement identiques entre elles et identiques à la bactérie mère.

10 1-2- Paramètres caractéristiques de la croissance dune bactérie

11 Temps de génération G Définition 1 ère partie : Temps nécessaire pour quune bactérie se reproduise et donne 2 cellules filles. 2 ème partie : En admettant que toutes les bactéries dune population se multiplient de façon synchrone, cest donc le temps nécessaire au doublement de la population. 11

12 Temps de génération G Expression Soit t : la durée pendant laquelle la bactérie se multiplie n fois G = t / n 12

13

14 14

15 Temps de génération G Paramètres influençant la valeur de G - La nature de la bactérie -Le milieu de culture : pour beaucoup de bactéries un milieu glucosé permet une croissance optimale car permettant un meilleur apport énergétique : G le plus petit -La température de culture * pour les bactéries mésophiles cest aux alentours de 30-37°C que G est le plus petit * pour les bactéries psychrophiles cest aux alentours de 20°C que G est le plus petit * pour les bactéries thermophiles cest aux alentours de 45°C que G est le plus petit 15

16 Taux de croissance r Définition 1 ère partie : Nombre de générations par unité de temps. Remarque : si lunité de temps choisi est lheure, r = taux de croissance horaire 16

17 Taux de croissance r Expression Soit t : la durée pendant laquelle la bactérie se multiplie n fois r = n / t Donc r = 1/G 17

18 Taux de croissance r Paramètres influençant la valeur de r : les mêmes que ceux influençant G - La nature de la bactérie -Le milieu de culture : pour beaucoup de bactéries un milieu glucosé permet une croissance optimale car permettant un meilleur apport énergétique : r le plus grand -La température de culture * pour les bactéries mésophiles cest aux alentours de 30-37°C que r est le plus grand * pour les bactéries psychrophiles cest aux alentours de 20°C que r est le plus grand * pour les bactéries thermophiles cest aux alentours de 45°C que r est le plus grand 18

19 Taux de croissance : nombre de multiplications par unité de temps Plus le taux de croissance est élevée, meilleure est la croissance du microorganisme

20 20 2- Etude expérimentale de la croissance bactérienne

21 2-1- Méthodes détude de la croissance

22 Dénombrements par comptage des colonies après culture

23 Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Technique dans la masse (en profondeur) Technique en surface 23 Voir TP

24 Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Principe : - Des dilutions selon une progression géométrique de raison 1/10 sont réalisées -Un volume connu de chaque dilution est introduit dans la masse ou en surface dun milieu gélosé -Après incubation les colonies sont comptées et, là où elles ne sont pas trop nombreuses, il est possible de considérer que chaque colonie provient d1 ufc présente dans linoculum -Calcul de la concentration en bactéries dans le produit de départ analysé en tenant compte du volume ensemencé et de la dilution. 24

25 Numération en milieu solide dans la masse

26 Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Remarque : Si faible concentration en bactéries (20 bactéries dans 100 mL) : - nécessité de faire le dénombrement en utilisant un grand volume, - possibilité de procéder par filtration. 26

27 Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Remarque : Si faible concentration en bactéries (20 bactéries dans 100 mL) : - nécessité de faire le dénombrement en utilisant un grand volume, - possibilité de procéder par filtration. 27 Principe : - Passage dun grand volume à travers un filtre dont les pores ont un diamètre inférieur à la taille des bactéries - Toutes les bactéries du volume filtré sont retenues sur le filtre - Dépôt du filtre à la surface dun milieu gélosé adéquat -Après incubation, comptage des colonies qui, si elles ne sont pas trop nombreuses proviennent chacune d1 ufc - Calcul de la concentration dans le produit filtré.

28 Schématisation de la technique de filtration sur membrane

29 Dénombrements par comptage visuel des microorganismes au microscope

30 Comptage direct des microorganismes Principe -Comptage des microorganismes sur des champs microscopiques -Calcul de la concentration des microorganismes dans le produit analysé. 30

31 Comptage direct des microorganismes Les diverses techniques -Comptage des microorganismes sur des champs microscopiques dun hématimètre de Malassez, de Thoma ou autre chambre de volume connu (avec possibilité de distinguer cellules vivantes et cellules mortes grâce au bleu de méthylène de Funk ou au bleu Trypan) -Comptage des microorganismes près coloration dun frottis réalisé par étalement dun volume connu dans un cercle de 1 cm2 : technique de Breed appliquée au lait -Technique du DEFT (Direct epifluorescence filter technic) 31

32 Escherichia coli en hématimètre de Thoma 32

33 Cercle de surface de 1 cm2 sur une lame de Breed 33

34 Comptage direct des microorganismes Principe du DEFT -Filtration dun volume de suspension sur une membrane (1 à 5 mL voire plus) -Coloration des microorganismes retenues sur la membrane par une molécule fluorescente (orange acridine par exemple colorant les cellules vivantes riches en ARN en rouge orangé et les cellules mortes en vert par fixation sur lADN) -Repérage et comptage des microorganismes colorées par observation microscopique de la membrane avec un microscope à épifluorescence (observation à lobjectif 100 à limmersion). 34

35 Comptage direct des microorganismes Avantages du DEFT -Meilleure sensibilité que les dénombrements en hématimètre car : -Dénombrement possible sur un plus grand volume -Amélioration de lobservation du fait de la coloration par un fluorochrome -Observation en épifluorecence. 35

36 Schématisation de la technique du DEF T novembre 2006Cellule procaryote36

37 Dénombrement par comptage automatisé des microorganismes

38 Comptage automatisé des microorganismes Principe : –Mise en suspension des microorganismes à dénombrer dans un liquide conducteur de l'électricité (ionique) – Aspiration du liquide au travers d'un orifice où sont placées deux électrodes entre lesquelles une ddp est appliquée –Si passage d une cellule relativement isolante entre les électrodes : diminution de la conductivité, augmentation de la résistance une augmentation de la ddp entre les deux électrodes 38 Détection dune impulsion à partir d'un seuil, impulsion correspondant à une seule cellule en raison de l'étroitesse de l'orifice..

39 Comptage automatisé des microorganismes Inconvénients : Méthode numérant les morts et les vivants Méthode pas applicable dans certaines conditions puisque des particules inertes présentes seront comptées comme des cellules. 39

40 Dénombrement par quantification dune présence microbienne : turbidimétrie

41 Dénombrement par quantification dune présence microbienne : turbidimétrie Principe : - Prélèvement mis dans une cuve de spectrophotomètre - Mesure du trouble dû à la présence de microorganismes car déviation des rayons lumineux par les microorganismes - Existence dune relation de proportionnalité entre A est proportionnelle à C. A = k. C novembre 2006Cellule procaryote41

42 Dénombrement par quantification dune présence microbienne : turbidimétrie Avantages et inconvénients Méthode très pratique, mais comptant les morts. Nécessité dau minimum 106 bactéries par cm3 pour faire la lecture sans que la concentration soit excessive. Impossibilité de mesure avec certains milieux ne permettent pas la mesure. Possibilité de perturbation de labsorption par le milieu d'où l'utilisation d'une longueur d'onde où elle est faible (600 nm par ex.). novembre

43 Dénombrement par quantification dune activité microbienne

44 Dénombrement par quantification de l ATP : ATP métrie Relation concentration en ATP et concentration en bactéries Toute cellule vivante produit et consomme de lATP Pas de fabrication dATP par les bactéries ou cellules mortes. Quantité dATP par cellule quasi constante dans une bactérie vivante, donc concentration en ATP proportionnelle à la concentration en cellules Conséquence Suivi de la variation de la concentration en ATP permet de suivre la variation de la concentration en bactéries 44

45 Dénombrement par quantification de lATP : ATP métrie Principe du dosage Possibilité de dosage facilement et rapidement lATP par la luciférase : Luciférine + ATP + O 2 oxyluciférine + AMP + P-P + CO 2 + h (562 nm) Conséquence : concentration en ATP est proportionnelle à l'intensité de la lumière émise C ATP = k h 45

46 46

47 Dénombrement par quantification d ATP : ATP métrie Intérêts. Méthode très rapide : 1 min, Méthode à seuil de détection très bas. Applications Quantification des microorganismes dans les aliments ou dans des produits environnementaux après lyse des cellules dans un milieu permettant de conserver l'ATP intact Contrôle de lefficacité des opérations de nettoyage désinfection dans le cadre de lHACCP après lyse des cellules dans un milieu permettant de conserver l'ATP intact Suivi de culture microbienne 47

48 Dénombrement par quantification dun métabolite ionisé : impédancemétrie Principe Activité métabolique libère des molécules ionisées (acides par exemple Production de molécules ionisées responsable dune diminution de la résistance du milieu et donc de limpédance en courant alternatif. Conséquence Suivi de la variation dimpédance permet de suivre la variation de production de métabolites ionisés et donc de suivre la variation de concentration microbienne. 48

49 Dénombrement par quantification dun métabolite ionisé : impédancemétrie Conséquence Diminution de limpédance : reflet de laugmentation de la concentration microbienne 49

50 2-2- Résultats des études de la croissance : courbe de croissance et son interprétation

51 La scissiparité : multiplication par 2 et ses conséquences

52 La multiplication par 2 et ses conséquences t= t0N0 = 1 t1= t0 + GN1 = t2 = t1 + G = t0 + 2GN2 = t3 = t2 + G = t0 + 3GN3 = ……….. tn = t0 + nGNn =

53 La multiplication par 2 et ses conséquences t= t0N0 = 1 = 2 0 t1= t0 + GN1 = 2 = 2 1 t2 = t1 + G = t0 + 2GN2 = 2. 2 = 2 2 t3 = t2 + G = t0 + 3GN3 = 2.4 = 2 3 ……….. tn = t0 + nGNn =2 n

54 La multiplication par 2 et ses conséquences t 0 N 0 t 1 (t0+ G) ) N 1 = 2 X N 0 t 2 ( G+ t1) N 2 = 2 X 2 X N 0 = 2 2 x N 0 t 3 (t0+ G) N 3 = 2 X 2 x 2 X N 0 = 2 3 x N 0 et ainsi de suite donc N = 2 n x N 0

55 La croissance bactérienne N = 2 n x N 0 N augmente de façon exponentielle La croissance est exponentielle

56 N = 2 n x N 0 Comme n = r t, alors N = 2 r t x N 0 56

57 Courbes de croissance

58 Courbe N = f(t) = 2 r t x N 0 N Courbe exponentielle Temps

59 Courbe log N = f(t) N = 2 n x N 0 donc logN = n x log2 + logN 0 logN = r x log2 x (t-t 0 ) + logN 0

60 y = a x x + b logN N Exponentielle Linéaire Temps

61 Les diverses phases de la courbe de croissance 4 5 temps Phase de latence Phase d'accélération Phase exponentielle de croissance Phase stationnaire Phase de déclin Phase de ralentissement log N Ln N

62 Signification de chaque phase a/ Phase de latence Définition : Phase caractérisée par : - absence de multiplications durant cette phase : r = 0 multiplication / h - adaptation du microorganisme au milieu : Synthèse denzymes inductibles pour métaboliser de nouveaux constituants Restauration denzymes altérées 62

63 Signification de chaque phase a/ Phase de latence Caractéristique : Durée variable de cette phase 63 Durée dépendant : - De la composition du milieu - De lâge des microorganismes - De linoculum - de la nature du microorganisme Plus le nouveau milieu est différent de lancien : - plus il faudra de temps pour synthétiser de nouvelles enzymes, - plus la durée de la phase de latence est longue Des microorganismes en phase de déclin mettront plus de temps pour restaurer leurs enzymes altérées Plus linoculum est important, plus la phase de latence a une durée réduite

64 Signification de chaque phase a/ Phase de latence Remarque : –Microorganismes prélevés en phase exponentielle dans un milieu X –Microorganismes réensemencés en milieu X 64 Pas de phase de latence (durée nulle)

65 Signification de chaque phase b/ Phase daccélération Définition : Phase durant laquelle –le nombre de bactéries adaptées et qui commencent à se multiplier devient de plus en plus grand –le rythme de multiplications est de plus en plus grand 65

66 Signification de chaque phase c/ Phase exponentielle Définition : Phase de multiplication optimale au cours de laquelle le nombre de bactéries augmente de façon exponentielle par rapport au temps (lnN ou log N augmente de façon linéaire dans le temps) et donc pendant laquelle : - r est constant et maximum - et donc G constant et minimum. 66

67 Signification de chaque phase c/ Phase exponentielle Caractéristique : Phase de multiplication optimale durant laquelle la valeur de r est constante et maximale 67 Valeur de r qui dépend : - Du microorganisme (§1) - Des conditions denvironnement * des facteurs physiques (température, O2, Disponibilité en eau, pH…..) * de la disponibilité en nutriments

68 Signification de chaque phase d/ Phase de ralentissement Définition : Phase pendant laquelle r diminue progressivement jusquà devenir nul 68 Causes de son existence : - Appauvrissement du milieu en certaines substances nutritives ou en certains gaz - Accumulation de certains déchets plus ou moins toxiques

69 Signification de chaque phase e/ Phase stationnaire Définition : Phase pendant laquelle r est nul et N reste constant car il ya équilibre entre : –Le nombre de bactéries disparaissant par lyse –Le nombre de bactéries apparaissant par multiplication lente 69 Causes de son existence : Dégénérescence dune partie des microorganismes compensée par lapparition de nouveaux microorganismes qui utilisent pour se multiplier les molécules libérées par la lyse des autres microorganismes

70 Signification de chaque phase e/ Phase stationnaire Causes de la lyse de certains microorganismes : –Epuisement total dune substance nutritive indispensable appelée substance limitante –Accumulation trop grande de déchets toxiques dans le milieu –Evolution défavorable de lenvironnement physique (ex : abaissement du pH). 70

71 Signification de chaque phase f/ Phase de déclin Définition : Phase pendant laquelle r est négatif car les microorganismes ne se multiplient plus et beaucoup dentre eux meurent et sont lysés. 71

72 Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de latence tLtL Temps de latence = t L Temps log N

73 Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de latence tLtL Temps de latence = t L Temps Log N

74 Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de génération G logN 2 logN 1 Lorsque la population double, N 2 = 2 x N 1 logN 2 = log2 + logN 1 logN 2 = 0,3 + logN 1 + 0,3 G Temps Log N

75 Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de génération G lnN 2 lnN 1 Lorsque la population double, N 2 = 2 x N 1 lnN 2 = ln2 + lnN 1 lnN 2 = 0,7 + lnN 1 + 0,7 G Ln N Temps

76 Détermination des paramètres de la croissance : Le taux de croissance horaire r logN 2 logN 1 temps logN =r x log2 x (t-t 0 ) + logN 0 donc pente = a = r x log2 pente donc r = log2 logN 2 - logN 1 avec pente = t2 – t1 + 0,3 Temps log N


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