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Transitoires calciques et différenciation neuronale Neuroblastes de la moelle épinière dembryon de xénope (HOLLIDAY and SPITZER 1990). Précurseurs neuraux.

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1 Transitoires calciques et différenciation neuronale Neuroblastes de la moelle épinière dembryon de xénope (HOLLIDAY and SPITZER 1990). Précurseurs neuraux de la zone ventriculaire de néocortex dembryons de rat (OWENS and KRIEGSTEIN 1998). Cellules de crêtes neurales troncales dembryons de souris (CAREY and MATSUMOTO 1999). Précurseurs de n eurones GABAergiques dembryons de drosophile (KUPPERS et al. 2003).

2 Transitoires calciques de neurones NT2N humains A B Gao et al. 1998, EJN 10: Control Ca 2+ 0 mM Nif. 10 µM GVIA 5 µMMVIIC 5 µM Ni 0.5 mM Ni 5 mM

3 Canaux calciques voltage-dépendants et différenciation neuronale Les canaux de type L sont indispensables à linduction neurale chez le xénope et sont régulés par noggin (Leclerc et al. 2000). Les canaux de type N déterminent le phénotype neurochimique GABAergique dans la moelle épinière dembryons de xénope via une régulation de lexpression de la GAD67 (Watt et al. 2000). Lexpression des canaux de type L est corrélée avec la maturation de lexcitabilité de neurones de Purkinje de rats néonataux (Liljelund et al. 2000).

4 Codage fonctionnel des transitoires calciques chez le xénope Les « spike » calciques de 2-3/h au niveau du soma déterminent la différenciation des neurones GABAergiques (Gu et Spitzer 1995). Les ondes calciques denviron 8/h au niveau du cône de croissance inhibent la pousse neuritique (Gomez et Spitzer 1999) Les transitoires calciques, denviron 10/min, des filopodes régulent le guidage axonal (Gomez et al. 2001).

5 Rôle des canaux calciques dans la différenciation neuronale Méthodologie: –Pharmacologie et électrophysiologie in vitro. –Transgenèse –Clonage in silico de canaux –Modulation in vivo des courants –Microscopie multiphotonique in vivo

6 Modèle animal : Xenopus laevis et tropicalis Xenopus laevis

7 Advantages du modèle Modèle d embryologistes Milliers doeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour limmuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2007 par le Joint Genome Institute » au NIH. F. TIAHO

8 Advantages du modèle Modèle d embryologistes Milliers doeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour limmuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le Joint Genome Institute » au NIH. F. TIAHO METHODES: solutions Dissection Marks Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM CaCl mM MgCl 2 1 mM Hepes 5 mM pH 7.8 Dissociation Barth Medium NaCl 88 mM KCl 1 mM NaHCO mM Na 2 HPO 4 2 mM KH 2 PO mM EGTA 0.5 mM pH 8.1 Culture Marks Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM MgCl 2 1 mM Hepes 5 mM CaCl 2 ±0.5 mM EGTA ± 1 mM pH 7.8

9 Fil de platine Pointe de pipette Pasteur 1. Couteau 2. Raquette

10 METHODES in vitro: dissection et culture des cellules neurectodermiques 1. Dissection2. Culture B D C A 1 mm Neurone C.I. C.E. 20 µm

11 Exemples de neurones

12 Advantages du modèle Modèle d embryologistes Milliers doeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour limmuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le Joint Genome Institute » au NIH. F. TIAHO METHODES: solutions Dissection Marks Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM CaCl mM MgCl 2 1 mM Hepes 5 mM pH 7.8 Dissociation Barth Medium NaCl 88 mM KCl 1 mM NaHCO mM Na 2 HPO 4 2 mM KH 2 PO mM EGTA 0.5 mM pH 8.1 Culture Marks Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM MgCl 2 1 mM Hepes 5 mM CaCl 2 ±0.5 mM EGTA ± 1 mM pH 7.8 F. TIAHO Propriétés des neurones différenciés Immunologie Ils sont tous 3A10 positifs. Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium. Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma. Dans les expériences suivantes les neurones sont définis par des critères morphologiques uniquement. F. TIAHO Analyses des neurones différenciés La calcein-AM et le propidium iodide sont utilisés pour distinguer les cellules vivantes et mortes. Les neurones sont identifiés par le critère morphologique. Le nombre de neurones ou leur pourcentage dans chaque boîte de Petri sont déterminés. Pour les statistiques, les tests de ou t-test de student sont utilisés. Les cellules sont observées à laide dun microscope à épifluorescence (Olympus IX70).

13 METHODES in vitro: 2. Electrophysiologie 50 µm Neurone Anti-islet1 Anti-myosin 1. Immunocytofluorescence 3A10 A1A1 A2A2 20 µm 3A10

14 F. TIAHO Propriétés des neurones différenciés Immunologie Ils sont tous 3A10 positifs. Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium. Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma. Pour dénombrer en routine les neurones dans les cultures nous utilisons le critère morphologique

15 ATP Ach IGF BTX Dépolarisation GVI-A Ni Ca 2+ Différenciation neuronale ? ? TRP Bilan des résultats Ca 2+ F. TIAHO

16 Groupe1Groupe2 Groupe 1AGroupe 1BGroupe 2AGroupe 2B Mercredi AM Prép. solutions Observation culture Dissection Prép. solutions Dissection Observation culture Mercredi PM Dissection Culture Dissection Culture Jeudi AM Comptage Prép. solutions Observation culture Dissection Prép. solutions Dissection Observation culture Jeudi PM Dissection Culture Dissection Culture Vendredi AM Comptage Vendredi PM Planification de la culture cellulaire

17 GROUPE 1AGROUPE 1B Nombre NOMPRENOMNOMPRENOM GROUPE 2AGROUPE 2B FICHE-GROUPES


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