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Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale.

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1 Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale

2 Exemples dutilisation en recherche fondamentale Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme

3 Approches pharmacologiques sur plantules Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires Zhu et al.

4 Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire

5 Hypersensitive Response (HR) Interactions plantes / pathogènes HR Mort cellulaire Circonscription du pathogène SAR Systemic Acquired Resistance : « Immunisation des plantes » Réaction rapide À plus long terme …

6 Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac 3 jours dinfection Nécroses = mort cellulaire Restriction de la propagation du virus Lam et al. (2001) Nature

7 Ehrenfeld et al Mol. Cells Composés phénoliques (autofluorescence) Mort cellulaire (Bleu Evans) Callose H2O2H2O2 Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible

8 Inconvénients du modèle plante entière Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments Mesures de flux difficiles Utilisation difficile dinhibiteurs

9 Utilisation de suspensions cellulaires Quantification de la mort cellulaire Utilisation dinhibiteurs Petites quantités Rapidité dabsorption Facilités dextraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS, NO…) Activités enzymatiques Extractions dARN

10 Estimation de la mort cellulaire Colorants des cellules vivantes : Fluoresceine diacétate Rouge neutre des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de propidium Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie

11 Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea H2OH2O Cryptogéine Prélèvements et comptage de la mort cellulaire au cours du traitement Cryptogéine heures % mortalité Témoin

12 Recherche dévènements précoces Cryptogéine heures % mortalité Témoin Que se passe-t-il pendant ces premières heures?

13 Synthèse des composés phénoliques H2OH2O Cry 50 µM Transcription du gène codant la PAL Zhang et al Plant Cell

14 Suivi des concentrations ioniques intracellulaires Exemple du calcium

15 Sondes calciques

16 Pénétration des sondes Problème : sondes chargées négativement, imperméantes Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM) Les molécules pénètrent les cellules Action desterases endogènes Libération des formes actives dans le cytoplasme

17 Inconvénients Sensibilité au pH : Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique plus qualitatif que réellement quantitatif

18 Suivi du calcium intracellulaire Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

19 Ca 2+ coelentérazine apoaequorine + + O 2 Ca 2+ + CO 2 +λ=469nm calcium Mode daction de la coelentérazine

20 Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium Temps (min) Cry (0.5 mM Ca 2+ ) Cry (0.4 mM Ca 2+ ) Cry (0.3 mM Ca 2+ ) Cry (0.2 mM Ca 2+ ) Cry (0.1 mM Ca 2+ ) ,4 [Ca 2+ ] cyt (µM) Lecourieux et al Plant Cell

21 Elaboration dun modèle de signalisation cellulaire Modèle très simplifié dune voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana) Cry Ca 2+ Phosphorylations (kinases) NO 3 - NADPH NADP H2O2H2O2 Mort cellulaire

22 Utilisation de protoplastes en recherche Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques

23 Étude de transports membranaires Minéraux, H 2 O Absorption racinaire Trafic vasculaire Relations Source / Puit Photoassimilats

24 Étude de transports membranaires Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale Les protoplastes : un modèle simple et pertinent

25 Étude de transports membranaires Traceurs isotopiques Sondes fluorescentes Electrophysiologie

26 Traceurs isotopiques Ni Incubation protoplastes + 63 Ni 10 µM 5 mn Ca Filtration et rinçage CaCl 2 2 mM s Filtre 0.45µM Comptage 63 Ni dans le filtre = Ni intracellulaire Ni

27 Sondes fluorescentes Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd) Lindberg et al. (2004) Planta

28 Utilisation des protoplastes en électrophysiologie

29 Caractérisation de canaux voltage- dépendants Voltage Clamp Patch Clamp Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ?

30 Voltage Clamp Une électrode enregistre les modifications de tensions La seconde impose une tension et corrige les variations Protoplaste Enregistrement des courants ioniques

31 Patch Clamp Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite forte résistance : mesure de courants faibles étude dun petit nombre de canaux

32 Patch Clamp : principes Imposition dun potentiel membranaire Mesure dun courant 100 pA 75 ms Assmann (2001) Plant Physiol. mV pA

33 Adressage des protéines Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP

34 Canaux et transporteurs membranaires Souvent : faible niveau dexpression Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire

35 Exemple dune P-ATPase ATP ADP P GFP Greffage dune GFP sur une partie soluble

36 Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Stucture « cannette de feuillets β » Spécificité de la GFP: pas de groupement prosthétique synthétisé séparément modification dacides aminés de la chaîne polypeptidique

37 Hexapeptide : FSYGVQ

38

39 Expression transitoire : principe Insérer un fragment dADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin Observation directe de lexpression Pas forcément dintégration chromosomique

40 Construction HMA4::GFP HMA4GFP2x35S Ori coli Ampi Réplication et sélection dans E. coli Protéine de fusionPromoteur

41 Transformation de protoplaste Préparer de grandes quantités de plasmide Transformation MaMg : Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl 2 (15 mM) Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane

42 Transformation de protoplastes Dans 300 µl de tampon 10 6 protoplastes 10 µg de plasmide 100 µg de « DNA carrier » 0-2 °C 300 µl PEG 40% 30 min sur glace Rinçage par dilution / sédimentation : NaCl, CaCl 2, Glucose

43 Expression Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri Incuber 4-48 heures à lobscurité Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)

44 Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4 Témoin : GFP soluble AtHMA4::GFP Verret et al. (2004) FEBS Lett.

45 Thomine et al. (2003) Plant J. Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3

46 Isolation de protoplastes spécifiques dune assise tissulaire Gène rapporteur GFP sous le contrôle dun promoteur spécifique dune assise tissulaire Prom GFP

47 Tri des protoplastes exprimant la GFP par cytométrie en flux Isolement de protoplastes de racines Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.

48 Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent Electrophysiologie Transcriptomique Protéomique

49 Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent Tri par cytométrie en flux Fluorescence GFP Contre marquage IP Nawy et al Plant Cell

50 Hybridation sur puces à ADN Nawy et al Plant Cell


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