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Vitrotechniques Principales techniques et applications.

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1 Vitrotechniques Principales techniques et applications

2 Plan Assainissement variétal – Culture de méristèmes Propagation de génotypes – Micropropagation – Embryogenèse somatique – Le problème de la variation somaclonale Sélection /Amélioration variétale – Création de variabilité – Sauvetage dembryons – Haplo/diploïdisation – Préparation et fusion de protoplastes Conservation génétique – Cryoconservation Vitrotechniques

3 Culture de méristèmes Assainissement de lignées

4 Obtention de lignées saines Principe : les méristèmes sont indemnes de virus (travaux de P. Limasset) Culture de méristèmes – Quelques 1/10 mm Régénération de plantes saines Sauvetage dembryons Attention : les lignées sont toujours sensibles à des infections ultérieures !!!

5 Applications Espèces à reproduction végétative – pomme de terre, bananier, artichaut, fraisier… – Normes sanitaires internationales Sauvetage dembryons Premiers succès dans les années 50 Service proposé par la plupart des sociétés de biotechnologies végétales

6 Micropropagation

7 Apex de tige ou bourgeons latéraux, Procédure en trois étapes (Murashige, 1974) – I : établissement du tissu en conditions dasepsie – II: multiplication de tiges feuillées – III: formation de racines et conditionnement de propagules avant transfert en serres Clonage très fidèle et très efficace – rosiers à partir dun bourgeon

8 Culture simple de nœuds : le bouturage in vitro Prolifération de pousses axillaires Problèmes : vitrification (hyperhydricité liée à la production déthylène) Micropropagation

9 Exemple de la pomme de terre : applications industrielles depuis près de 20 ans

10 Applications Horticulture, Sylviculture, Agronomie Les « grands succès » économiques – Banane – Orchidées – Pomme de Terre Conservation de la biodiversité – plantes carnivores – Orchidées Micropropagation

11 Lindustrie de la micropropagation Gain de place Affranchissement des saisons Rapidité Qualité sanitaire et homogénéité Pour certaines espèces : pas dautres solutions Micropropagation

12 Millions de plants par an issus de la micropropagation Pays-Bas 7,4 61,5 France 2,740,5 Belgique50 Facteur limitant : main dœuvre Délocalisations Micropropagation

13 20 hottes à flux laminaire m 2 de serres 3 chambres de culture plants vendus chaque année Technivit (Bourges) Multiplication Assainissement Création variétale Vivai Battisitini (Italie) Exemples de PME réalisant de la micropropagation Micropropagation

14 Bioplant (Belgique) Propagation technology (UK) Micropropagation

15 Embryogenèse somatique

16 Génération dun embryon à partir dun méristème, dun cal ou de suspensions Embryogenèse somatique

17 Source : Pour mémoire : lembryogenèse zygotique Embryogenèse somatique

18 Pétioles de luzerne Mise en culture 2,4-D + kinétine 25°C 3 semaines, photopériode 16h, 75 µE Masses de cal (origine cambium vasculaire) renfermant des cellules initiales dembryons somatiques (origine épidermique) Dispersion en milieu liquide B5 (2,4-D + kinétine) 7 jours Développement des embryons : 5-7 jours Tamisage : fraction mm transférée sur milieu solide Exemple : la luzerne Embryogenèse somatique

19 Premier milieu de maturation (sucrose) Second milieu de maturation (ABA, 3 jours) Rinçage, deshydratation (15% H 2 O) Conservation : 1 an Source : Crop Science, University of Guelph Embryogenèse somatique

20 Choix des explants, éventuellement application dun stress pour les rendre compétents Exemple de réussite récente : 2003 : protocole dembryogenèse somatique chez Arabidopsis avec une étape de stress: Ikeda-Iwai et al. (2003) Plant J. Embryogenèse somatique

21 Obtention de semences pour des variétés stériles (ex: pommes de terre polyploïdes, bananier…) Semences « délite » pour des espèces allogames Solution pour la conservation despèces tropicales dont les semences sont dites « récalcitrantes » à la déshydratation Obtention rapide de semences « délite » pour des espèces ligneuses Possibilité de cultures en réacteurs : production de semences artificielles à grande échelle (gymnospermes) Applications Embryogenèse somatique

22 Application aux ligneux Embryogenèse somatique

23 Semences artificielles (synseeds) Embryogenèse somatique

24 Feijoa sellowiana Embryogenèse somatique

25 Vitrovariation Non-conformité de la multiplication

26 La vitrovariation Les plantes régénérées à partir de cals, de protoplastes ou de feuilles ne sont pas toujours des clones parfaits: – instabilité chromosomique, aneupleuïdies – différences morphologiques

27 J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169 Clone VClone C Clone A Clone B diploide Clone B chimère trisomique Clone C diploïde Clone C trisomique

28 J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169

29 Utilisation de la vitrovariation Mise à profit de la variation somaclonale dans le cadre de programmes de sélection – Sélection de cals tolérants à des stress Augmentation artificielle de la variabilité – Traitements chimiques – Radiations

30 Création de variabilité Mutagenèse

31 Exemples à lINRA dAngers UMR Génétique et Horticulture INRA/INH/Université dAngers Equipe : Méthodologie de la sélection et innovation variétale (A. Cadic) Arbres ornementaux : GIE Saphinov Pommier : SARL Novadi

32 Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Grand Bleu® Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Heavenly Blue Peu de variabilité dans les populations Micropropagation et mutagenèse par irradiation Amélioration dune plante ornementale : le Caryopteris

33 Vitropropagation (mise au point) Irradiation de bourgeons : rayons γ ( 60 Co) (trouver la dose adéquate) Sélection des mutants Acclimatation, croissance Perte des caractères (????) Stabilité des caractères Régénération des plantules Acclimatation, obtention de graines Semis et sélection sur la nouvelle génération 1er prix New Plants 99 - Paris Commercialisation INRA/SAPHINOV. Diffusion SAPHO

34 Forsythia variété 'Lynwood'. Micropropagation et mutagenèse par irradiation 1972 'Courtalyn' WEEK-END ® 'Courtasol' MAREE D'OR ® 'Courtacour' BOUCLE D'OR © INRA, A. Cadic Hybridation classique

35 Micropropagation et mutagenèse par irradiation 'Courtadur' GRENADINE ® 'Bristol Ruby' © INRA, A. Cadic Culture de plantules in vitro Doublement chromosomique à la colchicine Variété tétraploïdeVariété diploïde Variété triploïde (stérile) Allègement des soins dentretien Amélioration du Weigela

36 Variétés polyploïdes, stériles, fortement hétérozygotes Multiplication végétative Apport des biotechnologies dans lamélioration du Bananier Lamélioration génétique par croisement est impossible Presque toutes les variétés de bananes et de plantain découlent de mutations spontanées

37 Source FAO PROF. KSHANIKA SANNASGALA HIRIMBUREGAMA Colombo, Sri Lanka Mutagenèse par irradiation de vitroplants de bananiers Sélection de mutants de petite taille, à fructification précoce Possibilité de 4 récoltes tous les 2 ans (au lieu de 3) Impact sur la vie économique locale. Forte demande de plants issus de vitroculture

38 Problème de lirradiation de tissus méristématiques : obtentions de chimères Solution (chez le bananier): Embryogénèse à partir de suspensions cellulaires Démonstration que les embryons somatiques sont issus de cellules uniques Irradiation de suspensions de cellules embryogéniques γ γ

39 Sauvetage dembryon Culture de méristèmes

40 Incompatibilité du porte graine Les semences hybrides sont viables mais le développement ne peut se faire sur le pied mère Régénération de la plante par culture in vitro de lembryon Exemple de la triticale (Triticum x Secale) Sauvetage dembryons

41 Protoplastes Préparation, applications

42 Protoplastes Définition : cellule de plante, de bactérie ou de champignon débarrassée de sa paroi Protoplastes

43 Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Rupture mécanique des parois Milieu isotonique Protoplastes Faible rendement Vieille école :

44 Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Digestion enzymatique: Cellulase Pectinase Milieu isotonique Protoplastes Paroi primaire : 20-30% cellulose % hémicellulose et pectine

45 Purification de protoplastes Filtration – Tamis successifs 100 à 30 µm Rinçages Flottement sur coussin de saccharose – Saccharose 20%, 100g Contrôles – Absence de paroi : Calcofluor White – Viabilité : Florescein Diacetate (FDA) Théoriquement > 80 % viabilité

46 Culture de protoplastes Couche mince, milieu liquide Composition des milieux – Milieux MS (Murshige et Skoog), B5 (Gamborg)… – Maintenir un potentiel osmotique bas Glucose 0,35 M Glucose + mannitol – Doses élevées dhormones Deux auxine fortes (2,4-D + ANA) + cytokinine Densité élevée de protoplastes ( – / ml) Premiers temps à lobscurité : éviter loxydation

47 Intérêt des protoplastes Transformation génétique Régénération de plantes à partir de cultures de protoplastes Etudes déchanges de métabolites Fusion de protoplastes Protoplastes

48 Fusion de protoplastes Fusion spontanée (soja, maïs) Ca 2+ pH basique PEG Choc électrique Protoplastes

49 Exemple : fusion entre un protoplaste de poireau et un protoplaste de choux rouge Protoplastes Comment trier les hybrides ? Mais aussi : résistance à des xénobiotiques tri sur des caractères morphologiques

50 Comment se répartit le matériel génétique ? Protoplastes Cybrides (cytoplasmes hybrides) hybrides somatiques (addition des noyaux) noyaux mitochondries chloroplastes

51 Solanum melongena Solanum sysimbrifolium Ralstonia solanacearum Verticillium dahliae sensibilité Bonne tolérance Problème: fécondation croisée inefficace Application agronomique Collonier et al Plant Science Protoplastes

52 Confection de protoplastes à partir de 500 mg de feuilles de chaque espèce Ajustement de la densité à / ml dans 0.5M mannitol + 0.5mM CaCl 2 Mélanger les deux préparations dans une boite de Petri Alignement : courant alternatif 15s, 230, V.cm -1, 1 MHz Fusion : courant continu 2*45s 1200 V.cm -1 Collonier et al Plant Science Protoplastes

53 Après le choc électrique : milieu de culture M de glucose + PEG 250 mg/l + hormones : 2,4-D, zeatin, NAA 7 jours à lobscurité 15 jours à la lumière Milieu neuf : 2,4-D + BAP cal Milieu de régénération de tiges : zéatine et IAA Milieu de multiplication sans hormones Sélection des hybrides (400) 22 plants régénérés Collonier et al Plant Science Protoplastes

54 Comment être sûr quil sagit dhybrides ? Protoplastes

55 Détermination de la ploïdie par cytométrie en flux 4 hybrides Collonier et al Plant Science Protoplastes

56 Morphologie des hybrides Collonier et al Plant Science Protoplastes

57 Dénombrement des chromosomes respectifs GISH : Genomic In Situ Hybridization sonde : ADN de S. sysimbrifolium « coloré » à la fluoresceine Contre coloration : iodure de propidium 24 chromosomes de chaque Collonier et al Plant Science Protoplastes

58 Origine des gDNA et cpDNA RAPD pattern CAPS pattern Les chloroplastes sont de S sysimbrifolium !! Les ADN génomiques sont tous les deux présents Collonier et al Plant Science Protoplastes

59 Tolérance au flétrissement bactérien causé par Ralstonia S. melongena S. sysimbrifolia Hybride Collonier et al Plant Science Protoplastes

60 Haplo/diploïdisation Androgenèse, Gynogenèse

61 Des haploïdes : pourquoi faire ? Recherche de mutations récessives Haplo/diploïdisation : homozygotie 100% Des homozygotes : pourquoi faire ? Outil de sélection : espèces autogames, espèces allogames Haplo/diploïdisation

62 Obtention de plants haploïdes Haploïdisation spontanée – Parthénogenèse (cellules sac embryonnaire) Haploïdisation induite – Androgenèse in vitro – Gynogenèse in vitro – Parthénogenèse in situ Haplo/diploïdisation

63 Androgenèse Développement sporophytique (haploïde) par culture des gamétophytes mâles – Cultures danthères ou de microspores isolées Source : CNRC-IBP-Canada Haplo/diploïdisation Limite : albinisme dans certains cas

64 Gynogenèse Développement sporophytique de gamétophytes femelles obtention de plants haploïdes – Culture in vitro dovaires ou dovules – Pollinisation croisée – Utilisation de pollen irradié Haplo/diploïdisation Parthénogenèse in situ

65 Doublement des chromosomes Utilisation dagents mitoclasiques – Blocage de la polymérisation des microtubules Colchicine Oryzaline Contrôle de la ploïdie – Cytométrie en flux Haplo/diploïdisation

66 Le pommier : un matériel génétique difficile à étudier: Cycle reproductif lent (période juvénile 5-7 ans) Autostérilité Impossible dobtenir des lignées 100% homozygotes par la sélection classique Obtention de lignées haploïdes Doublement chromosomique Obtention dhaploïdes de pommier Source : Haplo/diploïdisation

67 Obtention des haploïdes Fécondation avec du pollen irradié à 200 Gy Récolte des graines et semis Première étape : sélection des haploïdes Source : Haplo/diploïdisation

68 Micropropagation des haploïdes Mise en culture dapex Multiplication (repiquage toutes les 5 semaines) Source : Haplo/diploïdisation

69 Doublement de chromosomes Recouvrir avec du milieu contenant de loryzaline µM Incuber 2 heures à 2°C Cultiver 1 mois Source : Haplo/diploïdisation

70 Source : Contrôle de la ploïdie Comptage des chromosomes Cytométrie en flux Haplo/diploïdisation

71 humidité relative 80% Microgreffage et sortie din vitro Source : Haplo/diploïdisation

72 Autres utilisation du doublement de chromosomes Obtention de lignées tétraploïdes – Robustesse – Stérilité exemple du schéma de production de graines de pastèques triploïdes F0 2N F-1 2N F0 4N colchicine F1 3N Pollinisateur 2N Fruits sans pépins

73 Cryoconservation

74 Définitions Conservation de matériel vivant à très basse température – Azote liquide (-196°C) – Vapeurs dazote (-150°C) Etat de vie suspendue, réversible Cryoconservation

75 Problématique : Conservation despèces en voie de disparition : objectif agronomique : réservoir de variabilité utilisable pour des plans de sélection objectif médical : réservoir de substances actives inconnues objectif éthique : préservation dune richesse de nature non-marchande Conservation de variétés agronomiques ou horticoles intéressantes Eviter de perdre les variétés tombées en désuétude Erosion génétique des espèces à multiplication végétative Graines récalcitrantes Espèces à multiplication végétative (pomme de terre, bananier, manioc) Souches de culture in vitro Conservation de graines orthodoxes à basse température : Le Kew Garden à Londres

76 Avantage : faible surface / jardin botanique Inconvénients : importantes charges de travail risque de pertes : contaminations, erreur humaine variations somaclonales Exmple : Conservation de cultures de bananes Cultures in vitro en conditions de croissance réduite : Cryoconservation

77 stockage à –196°C cryopreservation de cultures de tissus (100 espèces) cyopreservation de graines récalcitrantes (40 espèces) conservation de souches de cellules fortement productrices de métabolites secondaires conservation de tissus génétiquement modifiés Meilleure solution : la cryopreservation Cryoconservation

78 Principes Éviter la formation de cristaux dans le cytoplasme – Congélation rapide – Déshydratation des échantillons Séchage à lair Déshydratation par congélation lente Cryoconservation

79 Déshydratation par congélation Prérefroidissement (-40°C) Formation de cristaux dans le milieu extracellulaire Le cytoplasme reste en surfusion Abaissement du potentiel hydrique du milieu extracellulaire H2OH2O H2OH2O H2OH2O Déshydratation de léchantillon Cryoconservation

80 Vitrification du milieu intracellulaire Solidification non-cristalline du cytoplasme – Concentration de solutés osmoprotectants – Congélation rapide Cryoconservation

81 Substances cryoprotectrices DMSO, glycérol, proline Adaptation métabolique: – Froid – Réduction photopériode – ABA [solutés ] Sucres, proline, glycine bétaïne Cryoconservation


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