La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Vitrotechniques Principales techniques et applications.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Vitrotechniques Principales techniques et applications."— Transcription de la présentation:

1 Vitrotechniques Principales techniques et applications

2 Micropropagation

3 Apex de tige ou bourgeons latéraux, Procédure en trois étapes (Murashige, 1974) – I : établissement du tissu en conditions dasepsie – II: multiplication de tiges feuillées – III: formation de racines et conditionnement de propagules avant transfert en serres Clonage très fidèle et très efficace – rosiers à partir dun bourgeon

4 Multiplication par bourgeons axillaires Multiplication par bourgeons adventifs Problèmes : vitrification (hyperhydricité liée à la production déthylène) Micropropagation Acta agriculturae slovenica, , november 2004

5 Applications Horticulture, Sylviculture, Agronomie Les « grands succès » économiques – Banane – Orchidées – Pomme de Terre – Rhododendron – Fraisier Conservation de la biodiversité – plantes carnivores – Orchidées Micropropagation 32 millions de plants en 2004 en Allemagne

6 Winkelmann et al Plant Cell Tiss Organ Cult

7 Lindustrie de la micropropagation Gain de place Affranchissement des saisons Rapidité Qualité sanitaire et homogénéité Pour certaines espèces : pas dautres solutions Micropropagation

8 20 hottes à flux laminaire m 2 de serres 3 chambres de culture plants vendus chaque année Technivit (Bourges) Multiplication Assainissement Création variétale Vivai Battisitini (Italie) Exemples de PME réalisant de la micropropagation Micropropagation

9 Bioplant (Belgique) Micropropagation Lecture conseillée : Traud Winkelmann et al. Commercial in vitro plant production in Germany in 1985–2004. Plant Cell Tiss Organ Cult (2006) 86:319–327 En 2004 en Allemagne : 8 des 32 entreprises font 92 % de la production, avec pour chacune > plants /an

10 Culture de méristèmes Assainissement de lignées

11 Obtention de lignées saines Principe : les méristèmes sont indemnes de virus (travaux de P. Limasset) Culture de méristèmes – Quelques 1/10 mm Régénération de plantes saines Attention : les lignées sont toujours sensibles à des infections ultérieures !!!

12 Applications Espèces à reproduction végétative – pomme de terre, bananier, artichaut, fraisier… – Normes sanitaires internationales Premiers succès dans les années 50 Service proposé par la plupart des sociétés de biotechnologies végétales

13 Embryogenèse somatique

14 Génération dun embryon à partir dun méristème, dun cal ou de suspensions Embryogenèse somatique

15

16 Source : Pour mémoire : lembryogenèse zygotique Embryogenèse somatique

17 Explants = Pétioles Mise en culture 2,4-D + kinétine 25°C 3 semaines, photopériode 16h, 75 µE Masses de cal renfermant des cellules initiales dembryons somatiques Dispersion en milieu liquide B5 (2,4-D + kinétine) 7 jours Développement des embryons : 5-7 jours Tamisage : fraction mm transférée sur milieu solide Exemple : la luzerne Embryogenèse somatique

18 Premier milieu de maturation (sucrose) Second milieu de maturation (ABA, 3 jours) Rinçage, deshydratation (15% H 2 O) Conservation : 1 an Source : Crop Science, University of Guelph Embryogenèse somatique

19 Vers lidentification de régulateurs de lembryogénèse somatique … Pour le critère dembryogénèse somatique spontanée, par screening sur une population de plantes dont la mutation gain de fonction est inductible par un traitement chimique, identification du gène WUSCHEL

20 Comprendre la nature des cellules souches Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

21 Les gènes WUSCHEL et CLAVATA au coeur du processus dembryogénèse somatique

22

23 Obtention de semences pour des variétés stériles (ex: pommes de terre polyploïdes, bananier…) Semences « délite » pour des espèces allogames Solution pour la conservation despèces tropicales dont les semences sont dites « récalcitrantes » à la déshydratation Obtention rapide de semences « délite » pour des espèces ligneuses Possibilité de cultures en réacteurs : production de semences artificielles à grande échelle (gymnospermes) Applications Embryogenèse somatique

24 Dans le cadre dAgrotransformations Embryogenèse somatique Plant Cell Rep (2009) 28:1385–

25 Semences artificielles (synseeds) Embryogenèse somatique

26 Feijoa sellowiana Embryogenèse somatique

27 Vitrovariation Non-conformité de la multiplication

28 La vitrovariation Les plantes régénérées à partir de cals, de protoplastes ou de feuilles ne sont pas toujours des clones parfaits: – instabilité chromosomique, aneupleuïdies – différences morphologiques

29 J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169 Clone VClone C Clone A Clone B diploide Clone B chimère trisomique Clone C diploïde Clone C trisomique

30 J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169

31 Utilisation de la vitrovariation Mise à profit de la variation somaclonale dans le cadre de programmes de sélection – Sélection de cals tolérants à des stress Augmentation artificielle de la variabilité – Traitements chimiques – Radiations Base de données sur les variétés issues de « mutation breeding » 42 variétés en Francehttp://www-infocris.iaea.org/MVD/

32 Création de variabilité Mutagenèse et « mutation breeding »

33 Phénotypes travaillés type compact couleur des fruits autofertilité absence de graines précocité, date de maturité des fruits résistance aux maladies :

34 Exemples à lINRA dAngers UMR Génétique et Horticulture INRA/INH/Université dAngers Equipe : Méthodologie de la sélection et innovation variétale (A. Cadic) Arbres ornementaux : GIE Saphinov Pommier : SARL Novadi

35 Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Grand Bleu® Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Heavenly Blue Peu de variabilité dans les populations Micropropagation et mutagenèse par irradiation Amélioration dune plante ornementale : le Caryopteris

36 Vitropropagation (mise au point) Irradiation de bourgeons : rayons γ ( 60 Co) (trouver la dose adéquate) Sélection des mutants Acclimatation, croissance Perte des caractères (????) Stabilité des caractères Régénération des plantules Acclimatation, obtention de graines Semis et sélection sur la nouvelle génération 1er prix New Plants 99 - Paris Commercialisation INRA/SAPHINOV. Diffusion SAPHO

37 Forsythia variété 'Lynwood'. Micropropagation et mutagenèse par irradiation 1972 'Courtalyn' WEEK-END ® 'Courtasol' MAREE D'OR ® 'Courtacour' BOUCLE D'OR © INRA, A. Cadic Hybridation classique

38 Variétés polyploïdes, stériles, fortement hétérozygotes Multiplication végétative Apport des biotechnologies dans lamélioration du Bananier Lamélioration génétique par croisement est impossible Presque toutes les variétés de bananes et de plantain découlent de mutations spontanées

39 Source FAO PROF. KSHANIKA SANNASGALA HIRIMBUREGAMA Colombo, Sri Lanka Mutagenèse par irradiation de vitroplants de bananiers Sélection de mutants de petite taille, à fructification précoce Possibilité de 4 récoltes tous les 2 ans (au lieu de 3)

40 Problème de lirradiation de tissus méristématiques : obtentions de chimères Solution (chez le bananier): Embryogénèse à partir de suspensions cellulaires Démonstration que les embryons somatiques sont issus de cellules uniques Irradiation de suspensions de cellules embryogéniques γ γ

41 Quand même…on peut espérer des caractères positifs Application dune toxine qui joue le rôle deffecteur pour un pathogène Sélection de lignées de cals résistants à la toxine Sengor et al. Plant Growth Regul (2009) 58:201–209

42 Quand même…on peut espérer des caractères positifs Régénération et observation des caractères de résistance sur les plantes cultivées au champ Sengor et al. Plant Growth Regul (2009) 58:201–209

43 Sauvetage dembryon

44 Incompatibilité du porte graine Les semences hybrides sont viables mais le développement ne peut se faire sur le pied mère Régénération de la plante par culture in vitro de lembryon Exemple de la triticale (Triticum x Secale) Sauvetage dembryons

45 Protoplastes Préparation, applications

46 Protoplastes Définition : cellule de plante, de bactérie ou de champignon débarrassée de sa paroi Protoplastes

47 Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Rupture mécanique des parois Milieu isotonique Protoplastes Faible rendement Vieille école :

48 Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Digestion enzymatique: Cellulase Pectinase Milieu isotonique Protoplastes Paroi primaire : 20-30% cellulose % hémicellulose et pectine

49 Purification de protoplastes Filtration – Tamis successifs 100 à 30 µm Rinçages Flottement sur coussin de saccharose – Saccharose 20%, 100g Contrôles – Mortalité : Bleu Evans – Viabilité : Florescein Diacetate (FDA) Théoriquement > 80 % viabilité Protoplastes vivants Protoplastes vivants Protoplastes morts, déchets Protoplastes morts, déchets

50 Culture de protoplastes Couche mince, milieu liquide Composition des milieux – Milieux MS (Murshige et Skoog), B5 (Gamborg)… – Maintenir un potentiel osmotique bas Glucose 0,35 M Glucose + mannitol – Doses élevées dhormones Deux auxine fortes (2,4-D + ANA) + cytokinine Premiers temps à lobscurité : éviter loxydation

51 Intérêt des protoplastes Transformation génétique Régénération de plantes à partir de cultures de protoplastes Etudes déchanges de métabolites Fusion de protoplastes Protoplastes

52 Fusion de protoplastes Fusion spontanée (soja, maïs) Ca 2+ pH basique PEG Choc électrique Protoplastes

53 Exemple : fusion entre un protoplaste de poireau et un protoplaste de choux rouge Protoplastes Comment trier les hybrides ? Mais aussi : résistance à des xénobiotiques, auxotrophie tri sur des caractères morphologiques Theor Appl Genet (1999) 99:761–771 Thlaspi + tiges étiolées de B. napus cultivé à lobscurité

54 Comment se répartit le matériel génétique ? Protoplastes Cybrides (cytoplasmes hybrides) hybrides somatiques (addition des noyaux) noyaux mitochondries chloroplastes

55 Solanum melongena Solanum sysimbrifolium Ralstonia solanacearum Verticillium dahliae sensibilité Bonne tolérance Problème: fécondation croisée inefficace Application agronomique Collonier et al Plant Science Protoplastes

56 Confection de protoplastes à partir de 500 mg de feuilles de chaque espèce Ajustement de la densité à / ml dans 0.5M mannitol + 0.5mM CaCl 2 Mélanger les deux préparations dans une boite de Petri Alignement : courant alternatif 15s, 230, V.cm -1, 1 MHz Fusion : courant continu 2*45s 1200 V.cm -1 Collonier et al Plant Science Protoplastes

57 Après le choc électrique : milieu de culture M de glucose + PEG 250 mg/l + hormones : 2,4-D, zeatin, NAA 7 jours à lobscurité 15 jours à la lumière Milieu neuf : 2,4-D + BAP cal Milieu de régénération de tiges : zéatine et IAA Milieu de multiplication sans hormones Sélection des hybrides (400) 22 plants régénérés Collonier et al Plant Science Protoplastes

58 Comment être sûr quil sagit dhybrides ? Protoplastes

59 Détermination de la ploïdie par cytométrie en flux 4 hybrides Collonier et al Plant Science Protoplastes

60 Morphologie des hybrides Collonier et al Plant Science Protoplastes

61 Dénombrement des chromosomes respectifs GISH : Genomic In Situ Hybridization sonde : ADN de S. sysimbrifolium « coloré » à la fluoresceine Contre coloration : iodure de propidium 24 chromosomes de chaque Collonier et al Plant Science Protoplastes

62 Origine des gDNA et cpDNA RAPD pattern (Random Amplification of Polymorphic DNA) CAPS pattern (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) Les chloroplastes sont de S sysimbrifolium !! Les ADN génomiques sont tous les deux présents Collonier et al Plant Science Protoplastes

63 Tolérance au flétrissement bactérien causé par Ralstonia S. melongena S. sysimbrifolia Hybride Collonier et al Plant Science Protoplastes

64 Un autre exemple pour la phytoremédiation du zinc Brewer et al. Theor Appl Genet (1999) 99:761–771

65

66 Haplo/diploïdisation Androgenèse, Gynogenèse

67 Des haploïdes : pourquoi faire ? Recherche de mutations récessives Haplo/diploïdisation : homozygotie 100% Des homozygotes : pourquoi faire ? Outil de sélection : espèces autogames variétés lignées pures espèces allogames obtention de parents dhybrides Descendances en ségrégation pour analyses QTL Haplo/diploïdisation

68 Obtention de plants haploïdes In vivo Apparitions spontanées (rares) Méthodes particulières de pollinisation pollen irradié pollinisation croisée entre génotypes incompatibles In vitro Culture de gamétophytes immatures Haplo/diploïdisation

69 Androgenèse Développement sporophytique (haploïde) par culture des gamétophytes mâles – Cultures danthères ou de microspores isolées Haplo/diploïdisation Limite : albinisme dans certains cas

70 Gynogenèse Développement sporophytique de gamétophytes femelles obtention de plants haploïdes – Culture in vitro dovaires ou dovules – Pollinisation croisée – Utilisation de pollen irradié Haplo/diploïdisation Parthénogenèse in situ

71 Doublement des chromosomes Spontané (parfois) Utilisation dagents mitoclasiques – Blocage de la polymérisation des microtubules Colchicine Oryzaline Contrôle de la ploïdie – Cytométrie en flux Haplo/diploïdisation

72 Le pommier : un matériel génétique difficile à étudier: Cycle reproductif lent (période juvénile 5-7 ans) Autostérilité Impossible dobtenir des lignées 100% homozygotes par la sélection classique Obtention de lignées haploïdes Doublement chromosomique Obtention dhaploïdes de pommier Source : Haplo/diploïdisation

73 Obtention des haploïdes Fécondation avec du pollen irradié à 200 Gy Récolte des graines et semis Première étape : sélection des haploïdes Source : Haplo/diploïdisation

74 Micropropagation des haploïdes Mise en culture dapex Multiplication (repiquage toutes les 5 semaines) Source : Haplo/diploïdisation

75 Doublement de chromosomes Recouvrir avec du milieu contenant de loryzaline µM Incuber 2 heures à 2°C Cultiver 1 mois Source : Haplo/diploïdisation

76 Source : Contrôle de la ploïdie Comptage des chromosomes Cytométrie en flux Haplo/diploïdisation

77 humidité relative 80% Microgreffage et sortie din vitro Source : Haplo/diploïdisation

78 Autres utilisation du doublement de chromosomes Obtention de lignées tétraploïdes – Robustesse – Stérilité exemple du schéma de production de graines de pastèques triploïdes F0 2N F-1 2N F0 4N colchicine F1 3N Pollinisateur 2N Fruits sans pépins

79 Cryoconservation

80 Définitions Conservation de matériel vivant à très basse température – Azote liquide (-196°C) – Vapeurs dazote (-150°C) Etat de vie suspendue, réversible Cryoconservation

81 Problématique : Conservation despèces en voie de disparition : objectif agronomique : réservoir de variabilité utilisable pour des plans de sélection objectif médical : réservoir de substances actives inconnues objectif éthique : préservation dune richesse de nature non-marchande Conservation de variétés agronomiques ou horticoles intéressantes Eviter de perdre les variétés tombées en désuétude Erosion génétique des espèces à multiplication végétative Graines récalcitrantes Espèces à multiplication végétative (pomme de terre, bananier, manioc) Souches de culture in vitro Conservation de graines orthodoxes à basse température : Le Kew Garden à Londres

82 Avantage : faible surface / jardin botanique Inconvénients : importantes charges de travail risque de pertes : contaminations, erreur humaine variations somaclonales Exmple : Conservation de cultures de bananes Cultures in vitro en conditions de croissance réduite : Cryoconservation

83 stockage à –196°C cryopreservation de cultures de tissus (100 espèces) cyopreservation de graines récalcitrantes (40 espèces) conservation de souches de cellules fortement productrices de métabolites secondaires conservation de tissus génétiquement modifiés Meilleure solution : la cryopreservation Cryoconservation

84 Principes Éviter la formation de cristaux dans le cytoplasme favoriser la vitrification = solidification non-cristalline – Congélation rapide – Déshydratation des échantillons Séchage à lair (sous flux, atmosphère faible hygrométrie) Déshydratation par prérefroidissement – Accumulation dosmoprotectants Déshydratation, froid Acide abscissique Ajouts de composés osmoprotecteurs Cryoconservation

85 Déshydratation par congélation Refroidissement progressif coûteux Prérefroidissement (-40°C) Formation de cristaux dans le milieu extracellulaire Le cytoplasme reste en surfusion Abaissement du potentiel hydrique du milieu extracellulaire H2OH2O H2OH2O H2OH2O Déshydratation de léchantillon Cryoconservation

86 Substances cryoprotectrices DMSO, glycérol, proline Adaptation métabolique: – Froid – Modulation photopériode – ABA [solutés ] Sucres, proline, glycine bétaïne Cryoconservation

87 Définitions germoplasme : Entité biologique dotée dune composition génétique distincte Accession : Germoplasme identifié comme appartenant à une collection (GeneBank)


Télécharger ppt "Vitrotechniques Principales techniques et applications."

Présentations similaires


Annonces Google