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Travail réalisé sous la direction de
28 Octobre 2005 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électrons M. Le président, Messieurs les membres du jury, mesdames et messieurs, Je vais vous présenter aujourd’hui Travail réalisé sous la direction de Mohammed BOUJTITA
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Objectifs de cette étude
Projet global: Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à l’analyse par injection en flux continu Questions préliminaires: Caractéristiques des encres conductrices ? Transfert direct possible? Utilisation en AIFC ? Introduction
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Analyse par injection en flux continu
Introduction
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Analyse par injection en flux continu
Technique dynamique Détection ampérométrique Avantages Analyse rapide et automatisable Appareillage simple et peu coûteux Contraintes Mise au point d’une cellule d’analyse adaptée Optimisation des méthodes d’immobilisation des composants Introduction
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Plan de la présentation
Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate
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La sérigraphie: principe général
raclette écran substrat Porte-substrat Film imprimé cadre encre 1. Les électrodes sérigraphiées
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DEK 245: Machine semi-automatique
Raclette Support écran Pompe Porte-substrat 1. Les électrodes sérigraphiées
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Les électrodes sérigraphiées
Support Contre Électrode Électrode de Référence Électrode Indicatrice Couche Diélectrique Électrodes prêtes à l’emploi jetables Facilité d’utilisation Production à grande échelle rapide et peu coûteuse 1. Les électrodes sérigraphiées
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La cellule de détection
Cellule de type « wall-jet » sortie entrée 1. Les électrodes sérigraphiées
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Différentes configurations possibles
II III Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) 1. Les électrodes sérigraphiées
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Particules conductrices Graphite Peroxydase de raifort (HRP)
Encre biocomposite Particules conductrices Graphite Polymère Acétate de cellulose Encre biocomposite Solvant Cyclohexanone Enzyme Peroxydase de raifort (HRP) Impression de l’électrode en une seule étape Optimisation indispensable de la composition 1. Les électrodes sérigraphiées
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Plan de la présentation
Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate
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Préparation de l’encre conductrice
Poudre de graphite + Liant = Encre (27 %) (73 %) Homogénéisation par malaxage mécanique Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…) 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Conditions expérimentales
Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère Acétate de cellulose (AC) PVC Couple Fe(CN)63-/Fe(CN)64- Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L-1 Voltampérométrie cyclique Spectroscopie d’impédance électrochimique 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Étude par voltampérométrie cyclique
Étude des cinétiques de transfert électronique ΔEp > 60mV Étude par voltampérométrie cyclique « Méthode de Nicholson » Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) ΔEp v k° Ψ = γα k° (πaDo)-1/2 γ = (Do/Dr)1/2 et a = nFv/RT AC 14% 23% 30% 103*k° (cm.s-1) 1,4 ± 0, 3 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Étude des cinétiques de transfert électronique
« Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C k° 1,4 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,3 ± 0,3 103*k° Butler-Volmer Nicholson 30% 23% 14% AC 0,4 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,24±0,06 0,38±0,1 0,55±0,09 α 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Étude des cinétiques de transfert électronique
« Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C k° α 14% 23% 30% AC 0,55±0,09 0,38±0,10 0,24±0,06 PVC 0,23±0,08 0,13±0,05 A = 2,0 ± 0, cm2 k° = 1,5 ± 0, cm.s-1 Limitation du transfert électronique par le polymère 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Étude morphologique de la surface de l’électrode
Rugosité de la surface x 200 MEB Électrode sérigraphiée (AC 14%) Qjg Rjg Rm Qdc 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Modélisation du comportement électrochimique de la surface
Circuit proposé : Qjg Rjg Rm Qdc Rtc Qdif Rdif Masse de l’électrode Surface et solution Qdc Rtc Qdif Circuit de Randles χ² < 10-4 14% AC 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Modélisation du comportement électrochimique de la surface
Circuit proposé : Qjg Rjg Rm Qdc Rtc Qdif Rdif Masse de l’électrode Surface et solution 2. Caractérisation électrochimique du transducteur
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Les électrodes sérigraphiées
Plan de la présentation Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate
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H202 I (nA) H20 HRP(red) HRP(ox) Biocapteur de troisième génération
Système étudié HRP(red) H202 H20 HRP(ox) I (nA) Biocapteur de troisième génération Transfert direct d’électrons 3. Modification de l’encre par la HRP
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Préparation de l’encre modifiée
= « Poudre modifiée » « Encre standard » Matériau conducteur: Carbone/graphite Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…) + Liant polymère + 3. Modification de l’encre par la HRP
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Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl
Utilisation en AIFC Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl 200 12,5 nA 5 min 50 100 25 nA 5 min 60 30 3. Modification de l’encre par la HRP
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Fonctionnement de l’électrode enzymatique
3. Modification de l’encre par la HRP
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Transfert direct HRP / graphite
Vitesse de balayage 20 mV/s Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl E°’= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl Couple de la HRP Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II) Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem E°’= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl Étude similaire pour la pâte de carbone: 3. Modification de l’encre par la HRP
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Mécanismes électrocatalytiques
Voltamogramme hydrodynamique E / V vs. Ag/AgCl -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 - D I / nA 100 200 300 400 H2O2 H2O 2e- ks k1 3. Modification de l’encre par la HRP
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Mécanismes électrocatalytiques
E / V vs. Ag/AgCl -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 - D I / nA 100 200 300 400 Vitesse de balayage: 20 mV/s Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl H2O2 TP 3. Modification de l’encre par la HRP
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Mécanismes électrocatalytiques
Mécanisme proposé R. Huang et N. Hu Bioelectrochem., 2001, H2O2 TP O2 TP 3. Modification de l’encre par la HRP
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Optimisation de l’encre biocomposite
3. Modification de l’encre par la HRP
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Acétate de cellulose (AC) ou PVC
Influence du polymère Acétate de cellulose (AC) ou PVC 14%, 23% ou 30% 14% 23% 30% AC PVC AC sensibilité linéarité Limitation de la diffusion 3. Modification de l’encre par la HRP
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Influence du solvant organique
HRP Mélange au solvant Séchage Électrode de référence Adsorption sur le graphite Électrode “ avant adsorption” Électrode “après adsorption” Malaxage avec l’huile de paraffine 81,8 8,6% 46,5 5,8 % Électrodes à pâte de carbone 100 % Influence du solvant sur l’adsorption 3. Modification de l’encre par la HRP
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Modification chimique de la HRP
Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase) Comment ? Oxydation par le NaIO4 (Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques) Diminution de l’activité enzymatique en solution HRP native HRP oxydée 3. Modification de l’encre par la HRP
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Étude quantitative du transfert direct d’électrons
Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à l’AIFC A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 1998, Pente (Med) Pente (TDE) = HRP en TDE HRP totale TDE Médiateur Ordonnée à l’origine 1/Ilim = f (V-3/4) 1/Icin TDE Med 3. Modification de l’encre par la HRP
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Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption
Modification chimique de la HRP Hypothèses: k1(nat) = 1,3.105 s-1.mol-1.L ; k1(ox) = 0,8 . k1(nat) = 1, s-1.mol-1.L A = 0,0314 cm2 Constante de vitesse relative au TDE: ks ≈ 3 s-1 36 ± 5 58 ± 5 % de HRP en TDE HRP oxydée HRP native 47 ± 1 19 ± 1 ΓHRP totale (pmol.cm-2) 17 ± 1 11 ± 1 ΓHRP TDE (pmol.cm-2) S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron., 2005, sous presse *A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004, Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption 3. Modification de l’encre par la HRP
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Plan de la présentation
Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate
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Électrode sérigraphiée bienzymatique
Système étudié Électrode sérigraphiée bienzymatique 4. Application à la détection du L-lactate
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Critères d’optimisation:
Plan d’expériences Critères d’optimisation: Sensibilité Zone de linéarité Choix des paramètres à étudier: 4. Application à la détection du L-lactate
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Plan d’expériences 2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC; Oxydation de la HRP
Essais 1 LOD 2 AC 3 Oxydation 1-2 1-3 2-3 1-2-3 Sensibilité (nA.mol.L-1) Linéarité (µmol.L-1) - + 1,30 (0,46) 8 - 76 68 (26) 0,70 (0,24) 5 - 40 35 (17) 0,73 (0,23) 5 - 73 68 (68) 4 0,62 (0,21) 110 (56) 5 0,87 (0,07) 170 (28) 6 0,88 (0,01) 130 (51) 7 0,27 (0,01) 165 (21) 8 0,37 (0,01) 230 (71) Effets E1 E2 E3 E12 E13 E23 E123 2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC; Oxydation de la HRP négatif positif 4. Application à la détection du L-lactate
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Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence)
Validation Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence) Solutions standards y = 1,10x + 0,005 4. Application à la détection du L-lactate
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Echantillons réels (UV = Méthode de référence)
Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits laitiers (riches en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate
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Produits à base de tomates
Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits à base de tomates (pauvres en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate
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Interférences à la détection du lactate
Interférent modèle: l’acide ascorbique AL 1:0 Réduction 1:0,5 1:1 Voltamogramme hydrodynamique (Acide ascorbique ) 1:2 AA 0:1 4. Application à la détection du L-lactate
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Mécanisme des interférences
Oxydation catalytique AA / HRP-ES AA / ES nue TP / HRP-ES P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002, S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, Mécanisme EC’ [HRP-Fe(II)](n-1)+ → [HRP-Fe(III)]n e- [HRP-Fe(III)]n+ + Asc- → [HRP-Fe(II)](n-1)+ + P 4. Application à la détection du L-lactate
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Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère
Conclusions Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère Transfert direct d’électrons entre le graphite et la HRP immobilisée Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II) Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation Influence des composants de l’encre sur les propriétés du biocapteur Limitation de la diffusion du substrat par le polymère Désorption de la HRP due à la présence d’un solvant organique Application à la préparation d’une électrode bienzymatique Méthode validée pour les produits laitiers Problème d’interférences avec l’acide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate
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Perspectives Poursuivre les études en impédance Caractériser la rhéologie des encres Etudier l’effet de l’oxydation sur l’activité de la HRP Comprendre l’influence du solvant Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP Résoudre le problème des interférences Adapter le procédé à la détection d’autres analytes
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Dr F. Fleury (Université de Nantes)
Remerciements Dr F. Fleury (Université de Nantes) Dr C. Cougnon (Université du Maine) N. Ruillé F. Ghamouss
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Merci pour votre attention
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