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1 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement dun biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct délectrons.

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1 1 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement dun biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct délectrons Travail réalisé sous la direction de Mohammed BOUJTITA 28 Octobre 2005

2 2 Objectifs de cette étude Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à lanalyse par injection en flux continu Introduction Projet global: Questions préliminaires: Caractéristiques des encres conductrices ? Transfert direct possible? Utilisation en AIFC ?

3 3 Analyse par injection en flux continu Introduction

4 4 Analyse par injection en flux continu Introduction Contraintes Mise au point dune cellule danalyse adaptée Optimisation des méthodes dimmobilisation des composants Avantages Analyse rapide et automatisable Appareillage simple et peu coûteux Technique dynamique Détection ampérométrique

5 5 1.Les électrodes sérigraphiées 2.Caractérisation électrochimique du transducteur 3.Modification de lencre par la HRP 4.Application à la détection du L -lactate Plan de la présentation

6 6 La sérigraphie: principe général raclette écran substrat Porte-substrat Film imprimé cadre encre 1. Les électrodes sérigraphiées

7 7 DEK 245: Machine semi-automatique Pompe Porte-substrat Support écran Raclette 1. Les électrodes sérigraphiées

8 8 Les électrodes sérigraphiées Support Contre Électrode Électrode de Référence Électrode Indicatrice Couche Diélectrique Électrodes prêtes à lemploi jetables Facilité dutilisation Production à grande échelle rapide et peu coûteuse 1. Les électrodes sérigraphiées

9 9 La cellule de détection 1. Les électrodes sérigraphiées Cellule de type « wall-jet » entrée sortie

10 10 Différentes configurations possibles IIIIII C E S L Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) Les électrodes sérigraphiées

11 11 Encre biocomposite Impression de lélectrode en une seule étape Optimisation indispensable de la composition Encre biocomposite Particules conductrices Graphite Enzyme Peroxydase de raifort (HRP) Solvant Cyclohexanone Polymère Acétate de cellulose 1. Les électrodes sérigraphiées

12 12 Plan de la présentation

13 13 Préparation de lencre conductrice Homogénéisation par malaxage mécanique Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…) Poudre de graphite + Liant = Encre (27 %)(73 %) 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

14 14 Conditions expérimentales Voltampérométrie cyclique Spectroscopie dimpédance électrochimique Couple Fe(CN) 6 3- /Fe(CN) 6 4- Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L -1 Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère Acétate de cellulose (AC) PVC 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

15 15 Étude par voltampérométrie cyclique AC14%23%30% 10 3 *k° (cm.s -1 ) 1,4 ± 0, 30,7 ± 0,10,4 ± 0,1 « Méthode de Nicholson » Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) ΔEp v k° Ψ = γ α k° (πaD o ) -1/2 γ = (D o /D r ) 1/2 et a = nFv/RT ΔEp > 60mV Étude des cinétiques de transfert électronique 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

16 16 « Équation de Butler-Volmer » 0,24±0,060,38±0,10,55±0,09 α 1,4 ± 0,31,3 ± 0,21,3 ± 0, *k° Butler- Volmer Nicholson 30%23%14%AC 0,4 ± 0,10,7 ± 0,11,4 ± 0, *k° I pc = nFk°AC exp(- (αnF/RT).(E p - E θ c ) I pc = -(3,01*10 5 )n 3/2 α 1/2 AD o 1/2 v 1/2 C αAαA k° 2. Caractérisation électrochimique du transducteur Étude des cinétiques de transfert électronique

17 17 « Équation de Butler-Volmer » I pc = nFk°AC exp(- (αnF/RT).(E p - E θ c ) I pc = -(3,01*10 5 )n 3/2 α 1/2 AD o 1/2 v 1/2 C αAαA k° 2. Caractérisation électrochimique du transducteur Étude des cinétiques de transfert électronique α 14%23%30% AC 0,55±0,090,38±0,100,24±0,06 PVC 0,23±0,080,24±0,060,13±0,05 Limitation du transfert électronique par le polymère A = 2,0 ± 0, cm 2 k° = 1,5 ± 0, cm.s -1

18 18 Étude morphologique de la surface de lélectrode MEB Électrode sérigraphiée (AC 14%) x 200 Rugosité de la surface Q jg R jg RmRm Q dc 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

19 19 Modélisation du comportement électrochimique de la surface χ² < Q dc R tc Q dif Circuit de Randles Circuit proposé : Q jg R jg RmRm Q dc R tc Q dif R dif Masse de lélectrode Surface et solution 2. Caractérisation électrochimique du transducteur 14% AC

20 20 Modélisation du comportement électrochimique de la surface Circuit proposé : Q jg R jg RmRm Q dc R tc Q dif R dif Masse de lélectrode Surface et solution 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

21 21 Plan de la présentation

22 22 Système étudié HRP(red) H202H202 H20H20 HRP (ox) I (nA) Biocapteur de troisième génération Transfert direct délectrons 3. Modification de lencre par la HRP

23 23 Préparation de lencre modifiée Encre modifiée Matériau conducteur: Carbone/graphite = Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…) + Liant polymère + « Encre standard » 3. Modification de lencre par la HRP « Poudre modifiée »

24 24 25 nA 5 min 60 Détection de H 2 O 2 (µmol.L -1 ) à 0 V vs. Ag/AgCl 30 Utilisation en AIFC 3. Modification de lencre par la HRP ,5 nA 5 min ,5 nA 5 min 12,5 nA 5 min

25 25 Fonctionnement de lélectrode enzymatique 3. Modification de lencre par la HRP

26 26 Transfert direct HRP / graphite Vitesse de balayage 20 mV/s Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl 3. Modification de lencre par la HRP Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem E°= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl Étude similaire pour la pâte de carbone: Couple de la HRP Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II) E°= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl

27 27 E / V vs. Ag/AgCl -0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4 - I / nA Mécanismes électrocatalytiques Voltamogramme hydrodynamique H2O2H2O2 H2OH2O 2e - ksks k1k1 3. Modification de lencre par la HRP

28 28 3. Modification de lencre par la HRP Mécanismes électrocatalytiques Vitesse de balayage: 20 mV/s Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl H2O2H2O2 TP E / V vs. Ag/AgCl -0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4 - I / nA

29 29 Mécanisme proposé R. Huang et N. Hu Bioelectrochem., 2001, Modification de lencre par la HRP Mécanismes électrocatalytiques O2O2 TP H2O2H2O2

30 30 Optimisation de lencre biocomposite 3. Modification de lencre par la HRP

31 31 Influence du polymère Acétate de cellulose (AC) ou PVC 14%, 23% ou 30% AC PVC 14% 23% 30% sensibilité linéarité Limitation de la diffusion 3. Modification de lencre par la HRP AC

32 32 Influence du solvant organique Influence du solvant sur ladsorption HRP Mélange au solvant Séchage Électrode de référence Mélange au solvant Séchage Adsorption sur le graphite Électrode avant adsorption Électrode après adsorption Malaxage avec lhuile de paraffine 81,8 8,6%46,5 5,8 % Électrodes à pâte de carbone 100 % 3. Modification de lencre par la HRP

33 33 Modification chimique de la HRP Comment ? Oxydation par le NaIO 4 (Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques) Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase) Diminution de lactivité enzymatique en solution HRP native HRP oxydée 3. Modification de lencre par la HRP

34 34 Étude quantitative du transfert direct délectrons Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à lAIFC Pente (Med) Pente (TDE) = HRP en TDE HRP totale TDE Médiateur A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 1998, Ordonnée à lorigine 1/I lim = f (V -3/4 ) 1/I cin TDE Med 3. Modification de lencre par la HRP

35 35 47 ± 119 ± 1Γ HRP totale (pmol.cm -2 ) 17 ± 111 ± 1Γ HRP TDE (pmol.cm -2 ) 36 ± 558 ± 5% de HRP en TDE HRP oxydéeHRP native Constante de vitesse relative au TDE: k s 3 s -1 *A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004, Formation de dimères* de la HRP avant ladsorption 3. Modification de lencre par la HRP Modification chimique de la HRP Hypothèses: k 1 (nat) = 1, s -1.mol -1.L ; k 1 (ox) = 0,8. k 1 (nat) = 1, s - 1.mol -1.L A = 0,0314 cm 2 S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron., 2005, sous presse

36 36 Plan de la présentation

37 37 Système étudié Électrode sérigraphiée bienzymatique 4. Application à la détection du L -lactate

38 38 Plan dexpériences Choix des paramètres à étudier: Critères doptimisation: Sensibilité Zone de linéarité 4. Application à la détection du L -lactate

39 39 Plan dexpériences Essais 1 LOD 2 AC 3 Oxydation Sensibilité (nA.mol.L -1 ) Linéarité (µmol.L -1 ) ,30 (0,46) (26) ,70 (0,24) (17) ,73 (0,23) (68) ,62 (0,21) (56) ,87 (0,07) (28) ,88 (0,01) (51) ,27 (0,01) (21) ,37 (0,01) (71) EffetsE1E1 E2E2 E3E3 E 12 E 13 E 23 E Application à la détection du L -lactate 2,4 U de LOD / mg ; 14 % dAC; Oxydation de la HRP négatif positif

40 40 Validation Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence) 4. Application à la détection du L -lactate y = 1,10x + 0,005 Solutions standards

41 41 Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) 4. Application à la détection du L -lactate Produits laitiers (riches en lactate)

42 42 Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) 4. Application à la détection du L -lactate Produits à base de tomates (pauvres en lactate)

43 43 Interférences à la détection du lactate Interférent modèle: lacide ascorbique 4. Application à la détection du L -lactate Voltamogramme hydrodynamique ) (Acide ascorbique ) Réduction AL 1:0 AA 0:1 1:0,5 1:2 1:1

44 44 Mécanisme des interférences 4. Application à la détection du L -lactate Oxydation catalytique P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002, S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, Mécanisme EC [HRP-Fe(II)] (n-1)+ [HRP-Fe(III)] n+ + e - [HRP-Fe(III)] n+ + Asc - [HRP-Fe(II)] (n-1)+ + P AA / ES nue AA / HRP-ES TP / HRP-ES

45 45 Conclusions Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère Transfert direct délectrons entre le graphite et la HRP immobilisée –Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II) –Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation Influence des composants de lencre sur les propriétés du biocapteur –Limitation de la diffusion du substrat par le polymère –Désorption de la HRP due à la présence dun solvant organique Application à la préparation dune électrode bienzymatique –Méthode validée pour les produits laitiers –Problème dinterférences avec lacide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate

46 46 Perspectives Poursuivre les études en impédance Caractériser la rhéologie des encres Etudier leffet de loxydation sur lactivité de la HRP Comprendre linfluence du solvant Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP Résoudre le problème des interférences Adapter le procédé à la détection dautres analytes

47 47 Remerciements Dr F. Fleury (Université de Nantes) Dr C. Cougnon (Université du Maine) N. Ruillé F. Ghamouss

48 48 Merci pour votre attention


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