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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,

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Présentation au sujet: "Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,"— Transcription de la présentation:

1 Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles Ferrédoxine-NADP + oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase : - présentation - transferts délectron, mécanismes Pierre Sétif CEA Saclay DSV/iBiTec-S/SB 2 SM Laboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène

2 Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible : les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique ("outer-sphere mechanism") Réactions chimiques (enzymatiques ou non) : les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique ("inner-sphere mechanism") D + A D + + A - En biologie : Distances centre à centre : Å Distances bord à bord : Å ("outer-sphere mechanism")

3 au sein d'une protéine Puits de potentiel : densité de probabilité (orbitale moléculaire) : énergie d'ionisation dans le vide D A Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir distance transfert d'électron possible Couplage électronique (faible) T DA

4 énergie potentielle x noyaux (d, ) (D + A) (D + + A - ) Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position Approximation de Born-Oppenheimer, principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale Conservation de l'énergie : la transition est horizontale x 0 (D, A) x 0 (D+, A-) (D + A) (D + + A - ) Tunneling de lélectron

5 (D + A) (D + + A - ) énergie de réorganisation G activation G activation = ( G ° + ) 2 4 G°

6 ( G° + ) 2 4 k B T - 1 k TE = T DA 2 exp 4 2 h Constante de vitesse de transfert d'électron k TE (théorie semi-classique de Marcus) couplage électroniqueénergie d'activation terme nucléaire (facteur de Franck-Condon) FC Conditions de validité : - faible couplage électronique T DA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, d bord à bord > 3-4 Å) - transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < k B T (traitement classique) G° : différence d'énergie libre entre létat final (D + A - ) et létat initial (D A) : énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV) T : température; k B : cte de Boltzmann; h : cte de Planck Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811,

7 région normale région inverse ( (d i, i )) = Cte G° < 0 (D + A) (D + + A - ) G activ. G° (d i, i ) G activ. = 0 log (k ET ) - G° 0 T DA = Cte ( G° + ) 2 4 k B T - 1 exp FC = G activation = ( G ° + ) 2 4

8 par rapport à WT WT P865* Bpha P865 + Bpha - Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376 membrane (bactériophéophytine a) (quinone) Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides) 0.3 eV P865 * (1 er état singulet excité): réducteur très fort Energie libre P865* Bpha P865 + Bpha - P865 Bpha s -1 G° (WT) = -0.2 eV 10 8 s -1 G° (WT) = -1.2 eV h

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10 Mélange à l'équilibre D A D + A - : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (k TE > ox - red ), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/k TE = h éch /k TE h d'où éch k TE Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles,...): - systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation dun ligand (hème-CO), photolyase,... - adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) : - complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine. - porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe. - flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu. Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) : - Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron. - Limitation cinétique ( > 1-2 ms). Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur lélectrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques

11 Lumière danalyse Excitation t I 0 0 I0I0 0 t 0 ΔA ΔA = - log (I/I 0 ) détection/amplification/ numérisation Echantillon Spectroscopie dabsorption par éclairs Résolution temporelle quasi illimitée Identification de la nature chimique des réactions grâce aux spectres dabsorption différentiels Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques)

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13 D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones) (American Society of Plant Physiologists) ATP et NADPH : assimilation du CO 2 en sucres (cycle de Calvin)

14 photosystème I cytochrome c 6 (plastocyanine) ferrédoxine (flavodoxine) FXFX FBFB FAFA A1A1 A' 1 A0A0 A' 0 P700 F B F A agrégats [4Fe-4S] F X A 1, A 1 ' : phylloquinones A 0, A 0 ' : chlorophylles a P700 : dimère de chl. a Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1 S de P700 h - < 500 ns + - < 10 ps, puis séparation primaire de charges

15 20 ps P700 + /P700 E m (V) (ref.: H + / H 2 at pH 0) P700 + /P700* A 0, A' 0 F X F A F B 1-3 ps 15 ns/200 ns h (700 nm) = 1.77 eV Fd P700 : dimère de chlorophylles a A 0, A' 0 : chlorophylles a A 1, A' 1 : phylloquinones F X, F A and F B : agrégats 4Fe-4S A 1, A' 1 FXFX FBFB FAFA A1A1 A' 1 A0A0 A' 0 P700

16 Jordan et al. (2001) Nature 411, kDa membrane Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å

17 Jordan et al. (2001) Nature 411, 909 Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs chlorophylles : transfert d'électron transfert d'excitation ("antenne")

18 Centres réactionnels photosynthétiques : - les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à loptimum: - G° =. Il sagit dune exception en biologie - les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que létape de transfert vers laccepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D + A - = P700 + Chla - ) Dans la plupart des réactions de transfert délectron biologiques : G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV 0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus

19 PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI - = (F A,F B ) - réactions de 1 er ordre éclair laser Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité :

20 PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI - = (F A,F B ) - 2 ème ordre éclair laser Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité :

21 Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I réactions de 1 er ordre 2 ème ordre éclair laser PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI - = (F A,F B ) -

22 Ferrédoxine (Fd) - Fd - (F A,F B ) - (Fd, (F A,F B ) - ) - (Fd -, (F A,F B )) Synechocystis 6803 : 3 phases de 1 er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C

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24 Ferrédoxine de cyanobactérie Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

25 Ferrédoxine de cyanobactérie Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017 résidus acides aspartique et acide glutamique : COO - résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0

26 membrane

27 PsaE PsaC PsaD membrane

28 diminution d'affinité augmentation d'affinité Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE

29 PsaE PsaC PsaD Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine membrane

30 photosystème I cytochrome c 6 (plastocyanine) ferrédoxine-NADP + - réductase (FNR) 2 e - ferrédoxine- thiorédoxine- réductase (FTR) 2 e - hydrogénase 2 e - nitrite réductase sulfite réductase 6 e - glutamate synthase (GOGAT)

31 Ferrédoxine-NADP + -oxydoréductase (FNR)

32 Nitrite réductase

33 Modèle dune hydrogénase dalgue verte

34 Ferrédoxine-NADP + oxydoréductase (FNR) Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20 2 Fd - + NADP + + H + 2 Fd + NADPH FAD (flavine adénine dinucléotide) 2 Fd - + FAD + H + 2 Fd + FADH - FADH - + NADP + FAD + NADPH flavineadénine

35 nm FNR (ferrédoxine-NADP + -réductase) 580 nm NiR (nitrite réductase) : PSI seul + - : PSI + Fd + FNR/NiR - : PSI + Fd + FNR/NiR

36 Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP + ) Observation de la FNR seule à 630 nm [FNR] PSI.Fd red PSI + Fd red k off Fd red + FNR ox Fd ox + FNR sq k1k1 k -1 k red = k 1 [FNR totale ] k ox = k -1 [Fd totale ] Conditions de pseudo-1 er ordre : [FNR totale ] >> [PSI] [Fd red ] et [FNR ox ] [FNR totale ] [Fd totale ] >> [PSI] [FNR sq ] et [Fd ox ] [Fd totale ]

37 k off = 800 s -1 k 1 = M -1 s -1 k -1 = M -1 s -1 C te d'équilibre rédox : K eq = k 1 / k -1 = 2.7 E 0 (Fd ox /Fd red ) - E 0 (FNR ox /FNR sq ) = (RT/F) ln(K eq ) = 25 mV E 0 (Fd ox /Fd red ) = -412 mV E 0 (FNR ox /FNR sq ) = -387 mV

38 PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI - = (F A,F B ) - FBFB FAFA k' on = M -1 s -1 K d = 0.45 µM = k off /k on k' on k off k" off = 800 s -1 K d k' on = 160 s -1

39 ferrédoxine oxydée ferrédoxine réduite surface de Fd à l'interface avec les partenaires Morales et al. (1999) Biochemistry 38, Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes Modèle proposé : après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k" off > k off

40 k 2 /k 1 = k 2 /k E 0 (FNR ox /FNR sq ) (-387 mV) < E 0 (FNR sq /FNR red ) ( -335 mV) [PSI] = 2.0 µM [Fd] = 4.0 µM [FNR] = 0.8 µM pas de NADP +

41 étape 7 : transfert dhydrure : FADH - + NADP + FAD + NADPH 2 Fd red 2 Fd ox

42 Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, Nitrite réductase

43 6 Fd - + NO H + 6 Fd + NH H 2 O agrégat 4Fe-4S hème protéine e-e- NO 2 - NH ° Nitrite réductase

44 hème agrégat 4Fe-4S ferrédoxine nitrite réductase Nitrite réductase 6 Fd - + NO H + 6 Fd + NH H 2 O Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, ferrédoxine [2Fe-2S] : E m = -410 mV agrégat [4Fe-4S] : E m = -370 mV sirohème : E m = -290 mV

45 Cycle catalytique de la nitrite réductase Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510

46 CF: piston; C, F: seringues; M: mélangeur; OC: cellule optique; I 0 : lumière incidente I: lumière transmise Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO 2 cinétique à 563 nm : k = 0.45 s -1

47 [Fd - ] = 3 µM [PSI] = 3 µM [Fd] = 6 µM réoxydation de Fd - par O 2 réoxydation de Fd - par NiR (catalyse) [NaNO 2 ] = 1.5 mM Réoxydation de Fd - nitrite réductase (NiR) Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s La fixation de NO 2 - sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse. Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités : - NO 2 - se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR - NO 2 - se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH 4 +,...

48 Modèle dune hydrogénase à fer dalgue verte Daprès la structure de lhydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, Fd H + H 2 2 Fd H + 2 Fd + H + + H - H + + H - H 2

49 centre fer-soufre cystéine pontante centre di-fer CO CN Cluster H H2H2 H+H+ H-H- Hydrogénase à fer

50 + - [PSI] = 2 µM photosystème I 540 nm La contribution de P700 + (charge positive) est soustraite

51 [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM photosystème I/ferrédoxine 540 nm La contribution de P700 + (charge positive) est soustraite

52 + + - ? photosystème I/ferrédoxine/hydrogénase [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM [HydA1] 0.16 µM 540 nm La contribution de P700 + (charge positive) est soustraite

53 540 nm -(d[Fd red ]/dt) t = 0 [HydA1] Initial rate of reoxidation of Fd red per HydA1 = [HydA1] = 0.16 µM : t = 0: 73 Fd red reoxidized per HydA1 per s [HydA1] = 0.32 µM : t = 0: 52 Fd red reoxidized per HydA1 per s -(d[Fd red ]/dt) t = 0 = k [Fd red ] t=0 = k [PSI] (exponential phase)

54 - Réduction de la ferrédoxine : cinétiques et site de fixation sur le photosystème I : Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David Rochaix Bernard Lagoutte, Hervé Bottin - Ferrédoxine-NADP + -réductase et nitrite réductase Sonya Kuznetsova, Nicolas CassanDavid Knaff Bernard Lagoutte Masakasu Hirasawa - Hydrogénase Tatiana Kuznetsova, Kateryna Sybirna Hervé Bottin


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