Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles

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1 Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles
- Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase : - présentation - transferts d’électron, mécanismes Pierre Sétif CEA Saclay DSV/iBiTec-S/SB2SM Laboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène

2  D + A  D+ + A- En biologie : Distances centre à centre : 8 - 25 Å
Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible : les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique ("outer-sphere mechanism") Réactions chimiques (enzymatiques ou non) : les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique ("inner-sphere mechanism")  En biologie : Distances centre à centre : Å Distances bord à bord : Å ("outer-sphere mechanism")

3 D A Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir
densité de probabilité (orbitale moléculaire) : Puits de potentiel : énergie d'ionisation dans le vide D A distance au sein d'une protéine transfert d'électron possible Couplage électronique (faible) TDA

4 (D + A) (D + A) (D+ + A-) (D+ + A-)
Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position Approximation de Born-Oppenheimer, principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale Conservation de l'énergie : la transition est horizontale (D + A) (D + A) (D+ + A-) (D+ + A-) énergie potentielle Tunneling de l’électron x0 (D, A) x0 (D+, A-) xnoyaux (d, )

5 (G ° + )2 Gactivation = 4  (D + A) (D+ + A-) G° Gactivation
énergie de réorganisation  (D + A) (D+ + A-) G° Gactivation Gactivation = (G ° + )2 4 

6 Constante de vitesse de transfert d'électron kTE
(théorie semi-classique de Marcus) couplage électronique énergie d'activation (G° + )2 4  kBT - 4   kBT 1 kTE = TDA exp 4 2 h terme nucléaire (facteur de Franck-Condon) FC G° : différence d'énergie libre entre l’état final (D+ A-) et l’état initial (D A)  : énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV) T : température; kB : cte de Boltzmann; h : cte de Planck Conditions de validité : - faible couplage électronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, dbord à bord > 3-4 Å) - transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < kBT (traitement classique) Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811,

7  ((di,i)) = Cte  TDA = Cte G° < 0 - - G°  log (kET)
Gactiv. G° (di,i) Gactiv.= 0 log (kET)  (G° + )2 4  kBT - 4   kBT 1 exp FC = région normale région inverse Gactivation = (G ° + )2 4  - G°

8 WT h par rapport à WT P865* Bpha P865+ Bpha-   0.3 eV P865 Bpha
Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides) (bactériophéophytine a) (quinone) membrane P865* (1er état singulet excité): réducteur très fort Energie libre P865* Bpha P865+ Bpha- P865 Bpha  1012 s-1 G° (WT) = -0.2 eV  108 s-1 G° (WT) = -1.2 eV h par rapport à WT WT P865* Bpha  P865+ Bpha- Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376   0.3 eV

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10 Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons
Mélange à l'équilibre D A  D+ A- : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = héch /kTE  h d'où éch  kTE Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) : - Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron. - Limitation cinétique ( > 1-2 ms). Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur l’électrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles, ...): - systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation d’un ligand (hème-CO), photolyase, ... - adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) : - complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine. - porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe. - flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu.

11 Spectroscopie d’absorption par éclairs
Excitation détection/amplification/numérisation Echantillon Lumière d’analyse t I I0 Résolution temporelle quasi illimitée Identification de la nature chimique des réactions grâce aux spectres d’absorption différentiels ΔA = - log (I/I0) ΔA Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques) t

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13 ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin)
D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones) (American Society of Plant Physiologists)

14 - - + < 10 ps < 500 ns photosystème I
Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1S de P700 h + - < 10 ps , puis séparation primaire de charges ferrédoxine (flavodoxine) - < 500 ns FX FB FA A1 A'1 A0 A'0 P700 FB FA agrégats [4Fe-4S] FX A1, A1' : phylloquinones A0, A0' : chlorophylles a P700 : dimère de chl. a photosystème I cytochrome c6 (plastocyanine)

15 + FX FB FA A1 A'1 A0 A'0 P700 P700 /P700* 1-3 ps -1.2 A , A' -1.0 20 ps -0.8 15 ns/200 ns A , A' F 1 1 X -0.6 F F B A Fd -0.4 h n (700 nm) = 1.77 eV -0.2 0.0 0.2 P700 : dimère de chlorophylles a A , A' : chlorophylles a 0.4 A , A' : phylloquinones 1 1 F , F and F : agrégats 4Fe-4S + X A B P700 /P700 E (V) (ref.: H+ / H2 at pH 0) m

16 Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å
membrane 400 kDa Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

17 transfert d'excitation ("antenne")
Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs chlorophylles : transfert d'électron transfert d'excitation ("antenne") Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

18 Centres réactionnels photosynthétiques :
- les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à l’optimum: - G° = . Il s’agit d’une exception en biologie - les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que l’étape de transfert vers l’accepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-) Dans la plupart des réactions de transfert d’électron biologiques : G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV   0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus

19 Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : réactions de 1er ordre éclair laser PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

20 Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : 2ème ordre éclair laser PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

21 Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : réactions de 1er ordre 2ème ordre éclair laser PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

22 (Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB))
Ferrédoxine (Fd) - Fd- (FA,FB) - (FA,FB)- (Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB)) Synechocystis 6803 : 3 phases de 1er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C

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24 Ferrédoxine de cyanobactérie
Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

25 Ferrédoxine de cyanobactérie
résidus acides aspartique et acide glutamique : COO- résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0 Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

26 membrane

27 PsaE PsaC PsaD membrane

28 Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE
diminution d'affinité augmentation d'affinité Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE

29 PsaE PsaC PsaD membrane
Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine

30 ferrédoxine-thiorédoxine-
glutamate synthase (GOGAT) ferrédoxine-thiorédoxine- réductase (FTR) nitrite réductase sulfite réductase 6 e- 2 e- ferrédoxine-NADP+- réductase (FNR) 2 e- 2 e- hydrogénase photosystème I cytochrome c6 (plastocyanine)

31 Ferrédoxine-NADP+-oxydoréductase (FNR)

32 Nitrite réductase

33 Modèle d’une hydrogénase d’algue verte

34 (flavine adénine dinucléotide)
Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase (FNR) FAD (flavine adénine dinucléotide) flavine adénine 2 Fd- + FAD + H+  2 Fd + FADH- FADH- + NADP+  FAD + NADPH 2 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPH Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20

35 - - - + + + 600 nm FNR (ferrédoxine-NADP+-réductase) 580 nm
NiR (nitrite réductase) : PSI seul + - : PSI + Fd + FNR/NiR - : PSI + Fd + FNR/NiR + -

36 Fdred + FNRox Fdox + FNRsq
Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP+) Observation de la FNR seule à 630 nm PSI.Fdred  PSI + Fdred koff Fdred + FNRox Fdox + FNRsq k1 k-1 [FNR] kred = k1  [FNRtotale] kox = k-1  [Fdtotale] Conditions de pseudo-1er ordre : [FNRtotale] >> [PSI]  [Fdred] et [FNRox]  [FNRtotale] [Fdtotale] >> [PSI]  [FNRsq] et [Fdox]  [Fdtotale]

37 koff = 800 s-1 k1 = 4.1  108 M-1s-1 k-1 = 1.5  108 M-1s-1
Cte d'équilibre rédox : Keq = k1/k-1 = 2.7 E0(Fdox/Fdred) - E0(FNRox/FNRsq) = (RT/F)  ln(Keq) = 25 mV E0(Fdox/Fdred) = -412 mV  E0(FNRox/FNRsq) = -387 mV

38 k'on < kon ou k"off > koff
FB FA PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)- k"off = 800 s-1 Kd  k'on = 160 s-1 k'on = 3.5  108 M-1s-1 Kd = 0.45 µM = koff/kon k'on < kon ou k"off > koff

39 Modèle proposé : k"off > koff
Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes ferrédoxine oxydée ferrédoxine réduite surface de Fd à l'interface avec les partenaires Modèle proposé : après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k"off > koff

40 pas de NADP+ k2/k1 = 1  0.25 k2/k-2  20
[PSI] = 2.0 µM [Fd] = 4.0 µM [FNR] = 0.8 µM k2/k1 = 1  0.25 k2/k-2  20 E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) < E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV)

41 étape 7 : transfert d’hydrure : FADH- + NADP+  FAD + NADPH
2 Fdred 2 Fdox

42 Nitrite réductase Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

43 e- Nitrite réductase 90° NO2- NH4+ protéine agrégat 4Fe-4S hème
6 Fd- + NO H+  6 Fd + NH H2O

44 agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV
Nitrite réductase 6 Fd- + NO H+  6 Fd + NH H2O hème agrégat 4Fe-4S ferrédoxine nitrite réductase ferrédoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

45 Cycle catalytique de la nitrite réductase
Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510

46 CF: piston; C, F: seringues;
M: mélangeur; OC: cellule optique; I0: lumière incidente I: lumière transmise Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO2 cinétique à 563 nm : k = 0.45 s-1 Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765

47 160 Fd réoxydées par NiR et par s
[Fd-] = 3 µM [PSI] = 3 µM [Fd] = 6 µM [NaNO2] = 1.5 mM Réoxydation de Fd-  nitrite réductase (NiR) réoxydation de Fd- par O2 réoxydation de Fd- par NiR (catalyse) Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s La fixation de NO2- sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse. Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités : - NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR - NO2- se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH4+, ...

48 Modèle d’une hydrogénase à fer d’algue verte
2 Fd- + 2 H+  2 Fd + H+ + H- H+ + H-  H2 2 Fd- + 2 H+ H2 D’après la structure de l’hydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 1853

49 H2 H+ H- CO CN Hydrogénase à fer centre di-fer Cluster H centre di-fer
centre fer-soufre Cluster H cystéine pontante H2 H+ H- CO CN centre di-fer

50 - + photosystème I [PSI] = 2 µM 540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite [PSI] = 2 µM 540 nm

51 - + photosystème I/ferrédoxine [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM 540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM 540 nm

52 - ? + photosystème I/ferrédoxine/hydrogénase [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite [PSI] = 2 µM [Fd] = 4 µM [HydA1] ≤ 0.16 µM 540 nm

53 -(d[Fdred]/dt)t = 0 = k  [Fdred]t=0 = k  [PSI] (exponential phase)
[HydA1] Initial rate of reoxidation of Fdred per HydA1 = -(d[Fdred]/dt)t = 0 = k  [Fdred]t=0 = k  [PSI] (exponential phase) 540 nm [HydA1] = 0.16 µM : t = 0: 73 Fdred reoxidized per HydA1 per s [HydA1] = 0.32 µM : t = 0: 52 Fdred reoxidized per HydA1 per s

54 - Ferrédoxine-NADP+-réductase et nitrite réductase
- Réduction de la ferrédoxine : cinétiques et site de fixation sur le photosystème I : Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David Rochaix Bernard Lagoutte, Hervé Bottin - Ferrédoxine-NADP+-réductase et nitrite réductase Sonya Kuznetsova, Nicolas Cassan David Knaff Bernard Lagoutte Masakasu Hirasawa - Hydrogénase Tatiana Kuznetsova, Kateryna Sybirna Hervé Bottin