Mesure des niveaux d'expression des gènes chez les bactéries par la technique des biopuces Analyse du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola.

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1 Mesure des niveaux d'expression des gènes chez les bactéries par la technique des biopuces Analyse du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola en condition de stress trophique de son hôte, le puceron Acyrthosiphon pisum Hubert Charles & Fédérica Calevro Laboratoire BF2I, UMR INRA/INSA de Lyon 203 Bât. Louis Pasteur, Villeurbanne, France. BSMC, Biologie Cellulaire et Modélisation Cellulaire DTAMB Université Claude Bernard Lyon 1

2 Inférer (ou valider) un modèle de réseau de régulation… à partir de données d’expressions de puces à ADN Temps (min) 22/6/05

3 Introduction : la technique des puces à ADN
HYBRIDATION LECTURE DE L’EMPREINTE DEPOT DES SONDES EXTRACTION DES DONNEES ET ANALYSE Extraction des ARNm Marquage des cibles A B D C Robot de dépôt Matériel biologique Cy5 Cy3 (1) (2) Choix des sondes Interprétation des résultats 85,6 13,1 1,3 Scanner Choix du plan de dépôt 22/6/05

4 De l’image de la puce… aux résultats interprétés
1. Nature des données d’expression 2. Problématique biologique 3. Mesure des données d’expression 31. Acquisition de l’image 32. Acquisition des données issues de l’image  33. Filtration des données 34. Analyse qualité 35. Normalisation 36. Gestion des données de puces 4. Plans expérimentaux 41. Plan de la puce 42. Analyses comparatives (statiques) 43. Analyses dynamiques 5. Conclusions 22/6/05

5 1. Nature des données d’expression
Grands volumes de données (pb logiciel, pb algorithmique) Dissymétrie du tableau de données (gènes x conditions) Les données sont relatives (pas de niveau 0, pas de mesure absolue) Distribution non-normale des données -> Transformation log2 Non-indépendance des données Des connaissances associées très hétérogènes (annotation par exemple) 22/6/05

6 2. Problématique biologique : la symbiose chez le puceron Acyrthosiphon pisum
Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la majorité des pucerons d’importance économique. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants. Buchnera complémente l’alimentation de son hôte (acides aminés et vitamines) Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères (adaptatives ?). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple) -> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable)  Le génome de Buchnera est « dégénéré » -> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ? -> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins nutritionnels de l’hôte ? 22/6/05

7 2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron
Expérience 1 (8 lames) : Milieu complet Milieu Tyr0/Phe0 A B 4 lames : A-Cy3 / B-Cy5 4 lames : A-Cy5 / B-Cy3 Expérience en flip-flop Analyse statistique : test de t-modifié (SAM), approche bayésienne 22/6/05

8 2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron
Expérience 2 (16 lames) : aa équilibré aa déséquilibré 0.5 M saccharose A B 1 M saccharose C D 2 répétitions indépendantes de 8 lames : A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A A B C D Analyse statistique : modèles d’analyse de la variance 22/6/05

9 3. Mesure des niveaux d’expression
31. Acquisition de l’image 32. Acquisition des données issues de l’image  33. Filtration des données : analyse qualité 34. Normalisation 35. Analyse statistique et interprétation des résultats -> Ces différentes phases ne sont pas distinctes 22/6/05

10 31. L’image brute 3ème oligo bloc (12 x 16) Oligo 3’ Oligo 5’
Doublets de spots Superposition des 2 images (R et G) Contrôles (+ et -) 22/6/05 aiguille 1 aiguille 2 aiguille 3 aiguille 4 =

11 32. Acquisition des données issues de l’image
Acquisition de l’image : réglage des PMT limite de la saturation (216) valeurs de PMT identiques (proches) pour toutes les lames d’un même jeu de données Quelle mesure du signal ? Volume du spot (peu utilisé) Moyenne (médiane) des pixels du spot Faut-il retrancher un bruit de fond local ? Estimation du bruit de fond sur les contours des spots (biais d’estimation) Estimation sur la base de témoins négatifs répartis sur toute la surface de la puce 22/6/05

12 33. Filtration des données durant l’acquisistion (logiciel GenePix)
Filtration des données (ajout de « flags ») Flag « absent » des spots vides (- 50) Flag « not found » des spots non détectés (- 75) Flag « bad » des mauvais spots (- 100) : Spots sous les taches et rayures (manuel), diamètres extrêmes, spots saturés (F635%sat, script Genepix), spots éloignés du nuage (moyenne / médiane), spots à forts CVF et CVB… Flag « good » des bons spots (+ 100) %B635+1SD > 55 et %B532+1SD > 55 (script GenePix) Flags (- 40) des valeurs corrigées négatives 22/6/05

13 Analyse de la variabilité (critères de qualité)
34. Analyse qualité Analyse de la variabilité (critères de qualité) Variabilité inter sondes identiques Variabilité intra-groupe de spottage Variabilité intra-gène Variabilité géographique Variabilité inter lames -> Utilisation de CV -> L’analyse de la variabilité permettra de décider de l’arrêt ou de la poursuite de la filtration puis du choix de la technique de normalisation 22/6/05

14 34. Analyse qualité : représentations graphiques
Bruit de fond Graphe RG MA plot Distribution de F532 22/6/05

15 35. Normalisation des données
Il n’existe pas de mesure absolue de fluorescence Les fluorochromes ont des propriétés différentes (linéarité du signal, quenching, sensibilité, stabilité…) Les PMT fournissent des valeurs relatives Les réactions de marquage ont des rendement différents ... -> Il est nécessaire d’effectuer une normalisation des données (la plus simple possible) 22/6/05

16 35. Normalisation : différents modèles
Soit Ig l’intensité du signal de fluorescence et xg l’abondance de l ’ARNm correspondant : Effet de bruit de fond : Effet de saturation (non linéarité de la détection) : Erreurs additives et multiplicatives : 22/6/05

17 35. Normalisation : différents modèles
Effet de saturation Effet des erreurs additives (faibles intensités) M=log2(R/G) Effet des erreurs multiplicatives (fortes intensités) Différence de bruit de fond entre vert et rouge 22/6/05 A=(RG)1/2 Cui et al. 2002

18 35. Normalisation des données : trois cas de figures
(1) Le nombre de gènes est très grand. (H) : La plupart des gènes analysés ne varient pas, ou se répartissent équitablement du coté des sur- et des sous-exprimés. -> Normalisation sur tous les points (2) Le nombre de gènes est moyen et H n’est plus applicable. On dispose d ’un échantillons de gènes invariants (contrôles, gènes de ménage) ou on calcule cet échantillon (Tseng et al., 2001). -> Normalisation sur l’échantillon de gènes invariants (3) le nombre de gènes est faible. Il faut disposer d’un jeu de contrôles répartis sur toute la gamme des intensités. -> Normalisation sur les contrôles 22/6/05

19 35. Normalisation globale
Normalisation « par la moyenne ou par la médiane » On calcule le rapport des moyennes (ou des médianes) pour les deux couleurs et on le rapporte à 1. La transformation : Le modèle sous-jacent : -> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique 22/6/05

20 35. Normalisation globale
Normalisation « par régression linéaire » Le modèle sous-jacent : La transformation est la suivante : -> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique 22/6/05

21 35. Normalisation globale
Normalisation « par régression linéaire locale» (fonction loess) Le modèle et la transformation sont les mêmes que précédemment, mais appliqués sur une classe d’intensité. -> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique 22/6/05

22 35. Normalisation locale (spatiale)
Toutes ces méthodes peuvent s’appliquer de façon à normaliser par groupe d’aiguille ou par bloc (effet géographique) -> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique -> coût sur H ou sur le nombre de témoins très importants 22/6/05

23 35. Normalisation des données Buchnera
La normalisation est basée sur un jeu de gènes invariants déterminé a posteriori Normalisation « PrintTip loess » 22/6/05

24 36. Un système d’informations pour la gestion des données de puces (SI-TRANS)
22/6/05

25 4. Plans expérimentaux 41. Plan de la puce
Les sondes doivent être spécifiques Les sondes doivent montrer des rendements homogènes Les sondes doivent être choisies dans des régions propices Les sondes devraient être réparties aléatoirement sur la lame Le nombre de répétitions doit être fixe pour toutes les sondes (calcul de moyennes) La puce doit comporter des témoins négatifs répartis sur toute la surface La puce doit comporter des témoins positifs répartis sur toute la gamme d’intensité si l’hypothèse de non variation de la majorité des gènes ne peut pas être faite. 22/6/05

26 4. Plans expérimentaux 22/6/05

27 4. Plans expérimentaux : analyse statique
- Comparaison de 2 conditions : Tests de t modifiés (SAM) ou inférence bayesienne - Comparaison de différentes conditions dans un plan factoriel : Modèles d’ANOVA - Comparaison de conditions multiples : Analyse discriminante, interclasse, non-supervisée A B C D A B C D R Plan en boucle Plan en référence 22/6/05

28 4. Plans expérimentaux : analyse dynamique
- Analyse à différents temps Profil d’expression temporel : classification supervisée ou non, corrélation de profils Cycle cellulaire, Cycle circadien : classification, transformée de fourrier, PLS… t1 t2 t3 t4 R = t1 ou asynchrone ou externe Plan en référence - Peng X et al. (2005) Identification of cell cycle-regulated genes in fission yeast. Mol Biol Cell. ;16(3): - Remondini et al. (2005) Targeting c-Myc-activated genes with a correlation method: Detection of global changes in large gene expression network dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. 10;102(19): - Luan Y & Li H (2004) Model-based methods for identifying periodically expressed genes based on time course microarray gene expression data. Bioinformatics. 12;20(3):332-9. 22/6/05

29 4. Plans expérimentaux : analyse dynamique
- Analyse à différents temps avec une covariable qualitative : Effet d’une drogue au cours du temps : analyse statique à chaque temps, sélection des gènes significatif pour 50% des temps, puis analyse des profils par classification t1 control traitement t2 control traitement t3 control traitement t4 control traitement t5 control traitement Plan en boucles répétées - Lin et al. (2004) Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells.Genome Biol. 2004;5(9):R6. 22/6/05

30 5. Conclusion Le plan d’expérience est primordial pour réaliser les analyses statistiques et ou la modélisation Toujours utiliser des plans en flip-flop Le modélisateur doit être partie prenante dans la préparation des données (qualité, filtration, normalisation) 22/6/05

31 5. Conclusions Sucrose effect inhibited by sucrose stress at 50% aa
Activated by sucrose stress at 25% aa atpH ftsY rpmG ytfN carB yba2 trpB flgB flgC yhbZ yleA yjjT rplS rpsL rpsF rpmB phrB pnp infB fliJ cvpA aceE murG grpE1 yfgB nth dnaJ guaC ygbB yqhA murB dnaG fabG fmt lipB yciL mopA argH yibN lig fabB dcd mesJ ydiC rplF yheM mutL iscU fldA hscA inhibited by sucrose stress at 25% aa Activated by sucrose stress at 50% aa Sucrose effect 22/6/05

32 5. Conclusions Recherche des gènes impliqués dans la réponse à un stress trophique chez Buchnera Recherche des voies métaboliques dans lesquelles ils sont impliqués Analyse des séquences régulatrices des gènes coexprimés Détection d’éléments régulateurs Analyse génomique et analyse de la corrélation entre le niveau d’expression et l’organisation du génome de Buchnera Détection de mécanismes de régulation 22/6/05