Techniques immunologiques

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1 Techniques immunologiques

2 Les techniques immunologiques sont principalement basées sur une intéraction entre l’anticorps et l’antigène

3 Techniques immunologiques
But : - Mise en évidence des antigènes - Mise en évidence des anticorps

4 Techniques immunologiques
Mise en évidence des anticorps (Ac) • Où ? : - essentiellement dans le serum plus rarement dans les autres liquides biologiques (LCR, salive, urine…) • Comment ? : au moyen d’antigènes: - le germe lui-même - les antigènes

5 Techniques immunologiques
Mise en évidence des antigènes (Ag) • Où : - dans les cellules - dans les tissus - dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…) • Comment : au moyen d ’anticorps - polyclonaux - monoclonaux

6 Réaction Ag-Ac : complexe immun
Interaction épitope-paratope Antigène soluble complexe Ag-Ac forme un précipité Antigène particulaire complexe Ag-Ac forme un agglutinat

7 ATTENTION : un Ac peut lui aussi être un Ag, vis à vis d’un Ac anti-Ac
ATTENTION : un Ac peut lui aussi être un Ag, vis à vis d’un Ac anti-Ac. un couple Ac/Ac anti-Ac peut être utilisé pour la mise en évidence Ag ou Ac.

8 Plusieurs découvertes majeures en sciences biomédicales n’auraient pas vu le jour sans l’utilisation d’anticorps

9 Techniques immunologiques
1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: - Immunofluorescence - Immunoenzymatique

10 Precipitation en milieu liquide
L'expérience consiste à répartir des quantités égales d'un solution d'un Ag multivalent avec des dilutions croissantes d'un sérum immun. 

11 Le test de l’anneau de précipitation est réalisé dans un tube
Antigène (soluble) Anticorps Zone d’équivalence : précipité visible

12 Précipitation sur gel Gel d’agar ou d’agarose
Intérêt : Les méthodes de précipitation en milieu gélifié sont appliquées à l'analyse qualitative d'un mélange d'Ag dans une solution. 1/ Immunodiffusion double ou réaction d'Ouchterlony 2/Immunodiffusion radiale (technique de Mancini)

13 Immunodiffusion double ou réaction d'Ouchterlony
Les solutions d'Ag et d'Ac sont déposées dans des puits percés à distance les uns des autres dans un gel d'agarose. Les molécules diffusent dans le gel en fonction de leur taille et forment des lignes de précipitation pour chaque système d'Ag et d'Ac. Chaque ligne de précipitation correspond à la zone d'équivalence respective, c'est-à-dire à la formation d'un réseau Ag-Ac.

14 Ouchterlony Cette méthode permet la comparaison directe de différents antigènes. Par exemple savoir si l’albumine de deux espèces proches possèdent les mêmes épitopes, des épitopes partiellement identiques ou des épitopes différents.

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16 Méthode d’Outcherlony
Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques : 1 : sérum de chèvre 2 : sérum de porc 3 : sérum de lapin 4 : sérum de boeuf 5 : sérum de cheval 6 : BSA

17 Réaction d'agglutination
La réaction d'agglutination met en présence des Ag sur un élément figuré (cellules, érythrocytes, particules, bactéries) et un antisérum contenant des Ac spécifiques agglutinants. Réaction d‘hémagglutination Quand les Ac se fixent aux Ag à la surface des GR du sang, la réaction d’agrégation résultante s’appelle hémaglutination.

18 Quel groupes sanguins? A B AB O

19 Techniques d'immunomarquage Immunodetection anticorps/antigène
IgA Radioactif Enzyme chromogène Fluorescence IgM

20 Immunodetection anticorps/antigène
Western blot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel (SDS PAGE) Détection par Ac primaire Détection de l’Ac primaire par un Ac secondaire couplé

21 Western blot 2. Transfert électrophorètique Séparation des
échantillons protéiques sur PAGE 2. Transfert électrophorètique Des Proteines du gel vers une membrane NC 3. Blockage de la membrane (lait ou BSA) 6.Incuber la membrane avec le substrat chemiluminescent de l’HRP et exposition du film 5. Incuber la membrane avec AC secondair conjugué à HRP 4. Incuber la membrane avec AC primair

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26 Exemple (clinique): détection d'Ac anti-HIV
Western blot Exemple (clinique): détection d'Ac anti-HIV Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif patients

27 Immunodetection anticorps/antigène
ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay -Sérum -Urine -Surnageant de culture Etc.

28 ELISA ELISA indirect ELISA Sandwich

29 Immunodetection anticorps/antigène
ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV