Identification bactérienne: Milieu de culture

Ce que vous devez savoir à propos du milieu de culture Quelles sont les sources de C,H,N,O,P,S? Quel est le type de milieu? Quels sont les indicateurs? Quels sont les agents sélectifs? Ce milieu permet à quelle(s) bactérie(s)de croitre? Quelle(s) est(sont) les réactions possibles?

Ex. Agar MacConkey Peptone - 17 g Protéose peptone - 3 g Lactose - 10 g Sels biliaires - 1.5 g NaCl - 5 g Rouge neutre - 0.03 g Cristal violet - 0.001 g Agar - 13.5 g Sources de C,H,N,O,P,S? Type de milieu? Indicateurs? Agents sélectifs? Permet la croissance de quelle(s) bactérie(s)? Réactions possibles?

Identification : Sources de carbones complexes

Utilisation de carbones complexes Trop gros afin d’être transporté à l’intérieur A besoin d’enzymes exocellulaires afin d’effectuer des dégradations externes Polysaccharides (amidon) Lipides (triglycérides, etc…) Protéines (caséine) Chaine poly nucléotidique (ADN)

Sources de carbones complexes: Amidon Milieu utilisé: Gélose d’amidon   Enzyme détectée: α-amylase Coupe le lien α-1,4 qui lie les monomères de glucose Identification: Iode (halo = digestion d’amidon)

Sources de carbones complexes: Amidon Avant l’ajout de l’iode Après l’ajout de l’ iode

Sources de carbones complexes : Protéines Milieu utilisé: Gélose de lait Enzyme détectée: caséinase (protéase) Clive les liens peptidiques qui relient les acides aminés dans la caséine Identification: Surface claire (halo) sous et aux alentours de la croissance

Sources de carbones complexes: Protéines

Sources de carbones complexes : Acides gras Milieu utilisé: Gélose de « Spirit Blue » Enzyme détectée: lipase Peut dégrader des gras complexes (triglycérides) en acides gras individuels Identification: « Spirit Blue » ((halo) sous et aux alentours de la croissance)

Sources de carbones complexes: Acides gras

Sources de carbones complexes : ADN Milieu utilisé: Gélose d’ADN   Enzyme détectée: ADNase Catalyse le clivage hydrolytique des liaisons phosphodiester dans la structure de l’ADN Identification: précipité de l’ADN polymérisé est opaque, donc la digestion de l’ADN est démontrée par un éclaircissement

Sources de carbones complexes: ADN

Identification: tests métaboliques Bouillon de phénol rouge Permet de déterminer la voie métabolique utilisée (oxidation ou fermentation) et la source de carbone optimale Contient des sources de carbones simples: Peptone (protéine  acides aminés) Un sucre désiré est ajouté Contient un indicateur de pH Phénol rouge Jaune- pH acide Orange - pH neutre Rouge- pH alcalin

Bouillons de phénol rouge – Interprétation Jaune (acide) + gaz = Fermentation de sucres Jaune (acide) pas de gaz = Fermentation de sucres Orange (neutre) pas de gaz = Oxydation de sucres Rouge (alcalin) pas de gaz = Oxydation de protéines Non-inoculé

TSI — Trois sucres et fer (Three Sugars and Iron) Glucose (agent limitant) Sucrose Lactose Protéines Cystéine Indicateur Phénol rouge

Tests IMViC Indoles, Méthyle-rouge, Vogues-Proskauer, Citrate (IMViC) Ces quatres tests individuels permettent de faire des séries de déterminations importantes qui se nomment collectivement la série de réactions IMViC La série de réactions IMViC permet la discrimination de bactéries provenant de la famille bactérienne Enterobacteriaceae

Tests IMViC : Méthyle-rouge Vogues-Proskauer Test méthyle-rouge : Fermentation avec accumulation d’acide : Glucose  pyruvate  acide lactique et/ou acide acétique + CO2 Test Vogues-Proskauer Fermentation avec accumulation de butandiol Glucose  pyruvate  acétoine  2 butandiol + CO2 - + - +

Test méthyle-rouge Test d’accumulation d’acide Sources de carbone: glucose et protéines Indicateur - méthyle rouge; ajouté après la croissance MR +: rouge (pH < 5.2) MR - : jaune (pH > 5.2) Neutre Acide

- + Test Voges-Proskauer Agents réactifs VP: butanediol + -naphthol + KOH + O2  acétoine VP + = rouge VP - = jaune - + Résultats attendus du test MR/VP: MR+/VP-; MR-/VP+ MR-/VP- Neutral Acid Acide produit Pas d’ Acétoine Neutre Acétoine

Tests IMViC : test d’indole Principal Certains microorganismes peuvent métaboliser le tryptophane en ayant recours à la tryptophanase Tryptophanase Tryptophane Indole + acide pyruvique + NH3 Agents réactifs de Kovac Couleur rouge

Test IMViC: utilisation du citrate Source de carbone unique Citrate Indicateur Bleu de bromothymol L’utilisation du citrate génère des produits finaux alcalins Change de couleur : du vert au bleu Positif Klebsiella, Enterobacter Negatif E. coli

Utilisation d’urée Enzyme testée Indicateur de pH Uréase Phénol rouge (devient rose) Positif Negatif C O + 2 H2O  CO2 + H2O + 2 NH3  (NH4)2CO3 H2N Urée carbonate d'ammonium (alcalin) Acides aminés

Utilisation d’urée – Phénol rouge

Essai de l’ornithine décarboxylase Détecte l’ornithine décarboxylase Catalyse la décarboxylation de l’ornithine Produit de la diamine putrescine et du dioxide de carbone (cause des changements alcalins) Indicateur: Bromo Crésol mauve Mauve lorsque le milieu est alcalin ou neutre Jaune lorsque le milieu est acide

Essai de décarboxylase d’ornithine Gauche: Alcalin avec et sans ornithine Centre: Alcalin avec ornithine, acide sans ornithine Droite: Acide avec et sans ornithine

Pente d’agar de phénylalanine Détecte la phenylalanine déaminase L’acide phényl-pyruvique réagit avec le chlorure ferrique afin de produire une couleur verte.

Pentes de phénylalanine B A: Positif pour l’acide phénylpyruvique B: Négatif pour l’acide phénylpyruvique

Pente d’agar de lysine Détecte la lysine décarboxylase Surtout utilisée afin de détecter des bactéries classifiées dans le groupe bactérien Enterobacteriaceae (par example, salmonelle) Indicateur: Bromo Crésol mauve

Pente d’agar de lysine: Bromo Crésol mauve

Pente d’agar de lysine Culot mauve: lysine décarboxylase positive Pente mauve: lysine déamination negative Culot jaune: fermentation glycolitique Pente rouge: lysine déamination positive Précipité noir: déamination sulfurique

SIM —Production de sulfide d’hydrogène, d’indole et la motilité (H2S, Indole and Motility) Milieu semi-solide Permet de visualiser la motilité Métabolisme de la cystéine CystéineH2S; H2S+ FeSO4 Précipité noir Métabolisme du triptophane (A) Tryptophane Indole + NH4 + Pyruvate (B) Indole + agent réactif Kovac  rouge

Non-motile Non inoculé Indole + - H2S et motile

Respiration anaérobique : Nitrate réductase 2 H+ 3 H+ + 3 OH - 3 H2O NO2- + H2O (N = +3) nitrite NO3- + 2 H+ (N = +5) nitrate 2 e- Fp Fe-S Q Cyt b NADH + H+ FADH2 Nitrate réductase Intérieur Extérieur Acceptor final d’e-

Respiration anaérobique : Nitrate réductase (suite…) NO3- + 2 H+ + 2 e-  H2O + NO2-  NO, N2O, NH2OH, NH3, N2 nitrate nitrite Étape 1: Test pour le nitrite NO2- + acide sulfanilique et alpha naphthylamine  HNO2 Nitrate n’est pas réduit Pas de nitrite Jaune Nitrate est réduit Production de nitrite rouge Nitrate est réduit en nitrite Nitrite est réduit

Respiration anaérobique : Nitrate réductase (suite…) NO3- + 2 H+ + 2 e-  H2O + NO2-  NO, N2O, NH2OH, NH3, N2 nitrate nitrite Étape 2: Test pour détecter la présence de nitrate NO3- + Zn (s)  NO2- Nitrate est présent Reduction en nitrite rouge Nitrate est absent Nitrite est réduit Jaune

Test d’oxidase: Respiration aérobique Chaine de transport d’électrons 3 H2O H+ 2 H+ 3 H+ + 3 OH- H2O 3 H+ + 1/2 O2 2 e- Fp Fe-S Q Cyt b Cyt o NADH + H+ FADH2 interieur extérieur

Test d’oxidase : respiration aérobique phénylènediamine Cytochrome oxydase catalyse la réduction d’un accepteur final d’électrons, l’oxygène. Un donneur artificiel d’e-, phénylène-diamine, est utilisé afin de réduire le cytochrome oxidase Si l’enzyme est présent, le réactif incolore (dans sa forme réduite) deviendra bleu (état oxidé)

Tests différentiels afin de faire l’identification de Cocci Gram Positifs

Hémolyse sanguine Milieu utilisé: Gélose de sang Enzyme détectée: hémolysine Identification: α-hémolyse: Teinte verte, dégradation partielle des globules rouges sanguines β-hémolyse: éclaircissement, dégradation complète des globules rouges sanguines et de l’hémoglobine γ-hémolyse: pas d’hémolyse

Hémolyse sanguine β α γ

Catalase Enzyme retrouvée dans la plupart des organismes vivant en présence d’oxygène Réduit le péroxide, ceci peut endomager la cellule (radical libre) Première étape afin de faire la discrimination entre : Micrococcaceae (catalase positive) Streptocaccaceae (catalase négative)

Catalase 2H2O2 2H2O + O2  catalase Product de respiration Est-ce que cette bactérie fait ceci? 2H2O2 2H2O + O2  catalase Product de respiration Endommage l’ADN Détection de bulles On ajoute ceci Ajoute 3% d’H2O2 à la croissance bactérienne bulles (O2) Métabolisme aérobique requiert la catalase

Autres cocci gram positifs Tests d’identification Bile-Esculine Bacitracine, optochine, et sensibilité à la novobiocine Mannitol + sels d’Agar Tellurite d’Agar ou Agar de Baird Parker Test Pyr

Multi Test: Enteropluri-test Tubes de tests métaboliques multiples Utilisation d’un inoculum constant Rapide Lecture peut être automatisé Préparations et inconsistances normalisé