CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES

Présentation au sujet: "CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES"— Transcription de la présentation:

1 CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES
Master 2 BCPP Épithéliums structures d’interface Université Paris Diderot Christine Clerici U700 – CRB3 UFR de Médecine Paris Diderot

2 MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE
MSC et greffe tissulaire : régénération des tissus réparation cardiaque ostéogénèse imparfaite MSC et propriétés immuno-modulatrices traitement de la GVH insuffisance rénale hépatite diabète LES CSM PEUVENT ÊTRE UTILISÉES A VISEE REGENERATIVE NOTAMMENT EN CARDIOLOGIE ET EN RHUMATO. Cependant des questions persistent en cardiologie après les essais cliniques: quels types cellulaires transplanter? quand les injecter? persistance a long terme capacité à se différencier en cellules cardiaques in vivo Dans le poumon : Les études ont montré une greffe des cellules souches mésenchymateuses dans l’épithélium alvéolaire normal ou pathologique (souris modèle de lesions a la bléomycine). Cette greffe restent toujours très faible environ 5% mais elles sont susceptibles de se différencier en cellules épithéliales. Ces études ont été très contestées par d’autres groupes qui ont montré une greffe de cellules souches <5%. De manière intéressante, un plus grand nombre de cellules greffées seraient retrouvées dans les animaux pathologiques que chez les controles LES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES Ont bien été montrées dans des modèles insuffisance rénale mais également dans des modèles de fibrose ou de bronchodysplasie.Les études sur l’effet des cellules souches mésenchymateuses montrent que les CSM peuvent être efficaces essentiellement par leur effets paracrines dans des modèles in vivo chez la souris de bronchodysplasie pulmonaire (exposition à 75% d’O2 chez des nouveaux nés) ou modèle animaux de fibrose à la bléomycine. Il semble qu’il s’agissent d’un effet mettant en jeu un grand nombre de facteurs diminution des facteurs pro-inflammatoires et augmentation des facteurs anti inflammatoires

3 MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE et PATHOLOGIES PULMONAIRES
MSC et greffe tissulaire : fusion ou repopulation? Poumon sain (Krause, 2001) Fibrose pulmonaire à la bléomycine (Ortiz, 2003; Kotton, 2004) Poumon radique (Theise, 2002) Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009) MSC et propriétés immuno-modulatrices Fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (Ortiz, 2007) Fibrose pulmonaire induite par la silice (Lassance, 2009) Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009; Aslam, 2009) MSC vecteurs thérapeutiques Engraftment : Administration of MSC resulted in various en-graftment rates ranging from 20% (Krause, 2001), 14% (33), and 4% (34), to 0% (13, 35- modèles non pathologiques). These discrepancies may be partly explained by numerous experimental variables including the various putative stem cells used, routes of administration, injury models, and methods of analysis to assess engraftment. Pour la greffe : les CSM pourraient se greffer au sein de l’épithélium lésé et se transformer en cellules épithéliales. En fait il est très difficile de dire s’il s’agit d’un phénomène de fusion ou de repopulation. Pour le phénomène de fusion Les expériences ont été effectutées chez des souris femelles irradiées et injectées avec des CSM de souris males exprimant la GFP. Les cellules épithéliales alvéolaires après 24h étaient tetraploides pour 25% d’entre elles et à 3 jours 8%, aucune a 7j. Pour le phénomène de repopulation: souris irradiées injectées avec des CSM exprimant la GFP. 6 mois plus tard, les poumons sont analysés après sacrifice et les etudes montrent que plus de la moitié des P1 et des P2 expriment la GFP. MSC acquired AEC phénotype in vitro :Bronchodysplasie (Von Haffen) In vitro, BMSCs developed immunophenotypic and ultrastructural characteristics of type II alveolar epithelial cells (AEC2) (surfactant protein C expression and lamellar bodies) when co-cultured with lung tissue, but not with culture medium alone or liver. Migration assays revealed preferential attraction of BMSCs toward oxygen-damaged lung versus normal lung. Les CSM peuvent acquérir un phénotype ce cellules épithéliales alvéolaires. Papier de 2009 de JCI qui montre que des CSM humaines cultivées dans certaines conditions avec des facteurs de croissance expriment la Clara cell secretory protein et que lorsque ces cellules CSM sont cultivées en interface air liquide elles expriment des marqueurs des pneumocytes de type I et de type II++ Immunomodulation : ortiz population de MSC capables de synthétiser de grande quantité d’IL-1ra qui antagonise l’IL-1a et diminue le TNF-a (ortiz), In vitro, BMSC-derived conditioned medium prevented O2-induced AEC2 apoptosis, accelerated AEC2 wound healing, and enhanced endothelial cord formation (Von Haffen). Npmbreux facteurs de croissance. Cependant l’effet bénéfique est une balance entre le fait que les MSC peuvent être stimulés par les facteures environnementaux et relarguer des cytokine pro infammatoires et leur effeets bénéfiques. CCL2 chemokine qui active les macrophages

4 MSC et Syndrome de détresse respiratoire aiguë
Les causes du SDRA In fections virales ou bacteriennes pulmonaires infections extrathoraciques trauma important

5 Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Efficaces dans le SDRA
Glucocorticoids Surfactant therapy Lisofylline Ketoconazole Inhaled nitric oxide Procysteine Neutrophil elastase inhibitor Activated Protein C La mortalité du SDRA a diminué au cours de ces dernières années puisqu’elle est passée de 40% à 23% du fait de la définition de meilleurs condiitons ventilatoires et de remplissage vasculaire. En revanche les traitements pharmacologiques sont restés inefficaces et les différentes essais thérapeutiques sont restés infructueux en termes de mortalité.

6

7 Quels effets des MSC dans des modèles pré-cliniques de lésions inflammatoires alvéolaires aiguës ?
1. MSC et ALI dans des modèles animaux Effets de CSM in vivo dans un modèle d’oedème alvéolaire induit par l’endotoxine chez la souris Effets des CSM in vivo dans un modèle de VILI chez la souris Effets des CSM in vivo dans un modèle de pneumopathie bactérienne 2. MSC et ALI dans un modèle de poumon humain : études in vitro et in vivo 7

8 EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND LUNG HISTOLOGY
IN MICE AFTER LPS E. COLI +4H +24/48H E.Coli IT MSC IT prélèvements 10 20 30 40 50 25 75 100 Hours 48 h Survival (%) PBS (n = 31) MSC (n = 30) ** **p < 0.01 Ces effets ne sont pas reproduit par l’instillation soit de fibroblastes soit de cellules CSM apoptotiques Dans ce modèle les MSC ne modifie pas le recrutement des neutrophiles contrairement au modèle de Xu ou le LPS est donnée IP Des résultats similaires ont été obtenus par l’equipe d’Ortiz dans un modèle de souris ou l’endotoxin est donnée par voie IP suivie une heure après d’injection IV de MSC. Les lésions inflammatoires induites dans ce modèle sont moins importantes que celles observées ici mais après 24h d’injection IV de MSC on note une normalisation de l’h’istologie pulmonaire. Cependant dans le modèle d’Ortiz, les MSC sont administrées de manière presque concomittante du LPS GUPTA ET AL, J IMMUNOLOGY, 2007

9 MSC REDUCES PULMONARY EDEMA AND BAL PROTEIN
IN MICE AFTER LPS MSC PBS **p=0.005 BAL Protein (mg/L) ** 1 2 3 4 5 PBS Excess Lung Water (µl) **p=0.001 50 100 150 200 250 MSC ** ELW and BAL protein sont modifiés a 48H mais pas a 24H

10 EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND PULMONARY EDEMA
IN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA +4H +24/48H E.Coli 106CFU IT MSC IT prélèvements 10 20 30 40 50 25 75 100 PBS (n = 13) MSC (n = 11) hours 48 h Survival (%) * A 150 200 250 300 PBS MSC 48 h Excess Lung Water (µl) B Gupta et al, unpublished data, 2009

11 EFFECT OF MSC ON BACTERIA GROWTH
IN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA Etude de la croissance des bactéries dans l’homogénat pulmonaire et dans le BAL MSC INDUIT UNE DIMINUTION DE LA CROISSANCE DES BACTERIES DANS LE LAVAGE ET L HOMOGENAT DE POUMON 18 HOURS APRES L INFECTION Krasnodembskaya, Stem Cells, 2010

12 MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.

13 MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.
PROTOCOLE VILI AVANT MSC ? Curley G F et al. Thorax 2012;67:

14 MSC THERAPY MODULATES THE INFLAMMATORY RESPONSE TO VILI.
Curley G F et al. Thorax 2012;67:

15 EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN
Lee JW et al, PNAS, 2009 15

16 EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN
- Right or left lung selected, surgical preparation - Begin perfusion without blood 4 h - Lung Temp 36°C Apply 10 cm H20 CPAP (95% O2 & 5% CO2 ) Measure AFC over 1 h in RUL (Control) If AFC >10%/h in RUL, Add 100 ml Fresh Whole Blood to Perfusate Instill 0.1 mg/kg of endotoxin into the airspaces of the RML in RML (endotoxin) Instill 5 x 10 allogeneic human mesenchymal stem cells or MSC conditioned medium to RML 6 VERIFICATION DE LA VIABILITE DU POUMON PAR LA MESURE DE LA CLEARANCE ALVEOLAIRE APRES &h DE STABILITE DE LA PREPARATION SI LA CL EST SUPERIEURE A 10%/H LE POUMON EST UTILISE 16

17 Absolute Neutrophil Counts
Control Lung Lobe LPS LPS + MSC LPS + MSC CM 8 ± 5 x 10 cells 6 25 ± 25 x 10 cells 13 ± 11 x 10 cells 6 ± 5 x 10 cells Absolute Neutrophil Counts P < 0.003 Pour le dosage des cytokines pro inflammatoires dans ce modèle l’administration de CSM ou du milieu conditionné ne modifie pas la concentration de TNF ni l’IL8 mais ramène au niveau contrôle la sécrétion d’iL-1beta Pour les cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et IL1-Ra pas de modification mais système isolé perfusé conservation du poumon lavage des alvéoles….. Donc dans ce modèle ce n’est pas l’effet anti inflammatoire qui est prédominant. Lee, PNAS, 2009 17

18 * * † † * † † EFFECT OF MSC ON ENDOTHELIAL PERMEABILITY AND PULMONARY
EDEMA IN HUMAN LUNG INJURED BY LPS A B 15 * 9 * 10 † Endothelial Permeability (%) Wed/Dry Ratio † 6 * † † 5 3 Control LPS LPS + MSC LPS + MSC CM Control LPS LPS + MSC LPS + MSC CM 18

19 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
Engraftment Immunomodulation Alveolar fluid clearance Lung protein permeability Antibacterial properties No, < 5%, Gupta et al., 2007

20 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ALI IN MICE :
IMMUNOMODULATION No cell contact : MSC secretion of soluble factors – modulation by the inflammatory environment? Cell-cell contact : Interaction with other inflammatory cells, leukocytes, macrophages…. Candidate mediators released or induced by MSC TGF-b TNF-a induced protein (TSG 6) PGE2 IL-10 IL-1ra ….. IL-1ra is a cytokine that competes competitively with IL-1b for IL_1 receptor binding. IL-1b is one of the major inflammatory cytokine in the BAL fluid of patients with ARDS

21 MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMUNOMODULATION
ALI - endotoxin ALI Pneumonia E. Coli MSC PBS MIP-2 BAL (pg/ml) TNF-α BAL (pg/ml) ** 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 500 1500 2500 3500 Cytokines pro inflammatoires: les MSC reduisent la libération de cytokines pro inflammatoires dans le BAL et le plasma MIP-2 (macrophage inhibiting protein) participe à l’influx neutrophiliques car il est un chemoattractant pour les neutrophiles. Dans l’etude le comptage des neutrophiles n’est pas différent entre la situation LPS ou LPS+MSC. Ceci s’explique par le fait que les CSM sont administréess 4H après le LPS et que la libération de chemoattractant pour les neutrophiles a deja été débuté et que les neutrophiles sont deja dans l’espace alvéolaire TNFa dans le BAL fluid pas différent? Cependant dans une expérience in vitro macrophages sur filtres et MSC en fond de boite, les macrophages timulés par du LPS libèrent moins de TNFa en presence de MSC et cet effet est indépendant du contact cellulaire. Krasnodembskaya, 2010 Gupta et al., 2007

22 MSC Upregulate Production of anti-inflammatory cytokines in Endotoxin Induced Lung Injury in Mice
PBS MSC 8 h BAL IL-10 (pg/ml) * 10 20 30 40 200 400 600 800 24 h BAL IL-10 (pg/ml) 24 h Plasma IL-10 (pg/ml) 1500 3000 4500 6000 7500 9000 Cytokine anti inflammatoire: les MSC augmentent la production de cytokines anti-inflammatoires IL-10: augmentation de la libération d’IL10 dans le BAL et le plasma a 8H et a 24H. L’IL-10 a été montré comme permettant de prevenir l’inflammation dans le poumon Les autres cytokines anti-inflammatoires: IL-1ra et IL-13- L’administration de MSC entraine une augmentation de l’IL1-ra et de l’IL-13. Cette augmentation de l’IL-1ra avait deja ete noté dans des études antérieures et son role est majeur puisqu’il est compète avec l’IL-1b puissante cytokine pro inflammatoire sur le recepteur. En revanche pas de modification de PGE2 qui est sécrété par les MSC En revanche PGE2 n’est pas modifié dans le BAL

23 Nemeth et al, Nat Med, 2009 (ALI dans un modèle de sepsis par LC)
Parallèlement a cette étude sur l’Ali une autre etude réalisé sur un modèle de sepsis sur la souris met en évidence le role majeur de l’IL10 dans l’effet bénéfique des MSC Le sepsis est produit par ligation caecale et les MSC sont administrées par voie intraveineuse soit avant soit quelques heures après la ligation caecale. Dans les deux cas les MSC diminue la mortalité. Cet effet est diminué si on utilise un anticorps anti IL10 ou des anticorps anti recepteur de l’IL10 Dans cette étude, les auteurs montrent également que l’IL10 n’est pas directement secrétée par les MSC mais que ces dernieres via la secretion de PGE2 et un contact direct avec les macrophages augmentent la secretion de ‘lIL10 des macrophages. Nemeth et al, Nat Med, 2009 (ALI dans un modèle de sepsis par LC)

24 MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMODULATION BY CELL-CELL INTERACTION
Bactéries entrainent une translocation de NKkb dans le noyau qui semble etre dependente du NO Augmentation de l’experssion et de la synthèse de PGE2 qui agit via des recepteurs EP2 et EP4 situés sur les macrophages sur la secretion d’IL10 et diminue l’inflammation Nemeth et al. Nat Med,2009

25 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
Engraftment Immunomodulation +++ Alveolar fluid clearance Lung protein permeability Antibacterial properties

26 MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN HUMAN LUNG: ALVEOLAR FLUID CLEARANCE
† 10 20 30 † Alveolar Fluid Clearance (%/h) * * Control Normal Lung Fibroblasts MSC MSC CM * P< vs. Control LPS † P< vs. LPS (0.1 mg/kg) 26

27 MSC induced increase in Na-dependent AFC
30 20 * Alveolar Fluid Clearance (%/h) 10 + MSC CM + MSC CM + 5 x M Amiloride -4 LPS Data as mean ± SD, * P < Lee JW et al, PNAS, 2009 27

28 † * † * * † * † * * ENaC Apical Membrane ENaC Total Cell Lysis
85 kDa 64 kDa GAPDH † 120 120 * † * 80 * % of Control 80 % of Control 40 40 Control + MSC Control +MSC Cytomix 50 ng/ml Cytomix 50 ng/ml 28

29 Quels facteurs paracrines susceptibles d’améliorer la clairance alvéolaire ?
Diminution des cytokines pro-inflammatoires et augmentation des cytokines anti-inflammatoires dans le modèle ALI souris mais pas dans le modèle poumon humain. Sécrétion de facteurs de croissance, KGF, angiopoietine-1 qui sont connus pour réduire les lésions pulmonaires dans les œdèmes lésionnels : bléomycine, VILI, hyperoxie, HCl, pneumopathie bactérienne. Pas d’augmentation des cytokines anti infl IL10 et IL1-Ra dans ce modèle et pas de diminution du TNFA ou de l’IL-8. Mais modèle très différent de la souris car il n’y a pas beaucoup de polynucléaires ou de monocytes comparés aux animaux intacts.

30 MSC sécrètent des facteurs de croissance
KGF Angiopoietin-1 concentration (pg/ml) Control Cytomix +3%O2 150 50 100 200 250 concentration (pg/ml) Control Cytomix * *

31 MSC IMPROVED ALVEOLAR FLUID CLEARANCE IN HUMAN LUNG: ROLE OF KGF
, # 30  20 Alveolar Fluid Clearance (%/hr) 10 *,  * Control LPS LPS + CM MSC + rhKGF (100ng) LPS + CM MSC (KGF siRNA) * P<0.001 vs. Control  P<0.03 vs. LPS (0.1 mg/kg) # P<0.01 vs. LPS + CM MSC (KGF siRNA)

32 Mécanismes responsables de la restauration de la clairance alvéolaire par le KGF
Effet mitogène sur les cellules alvéolaires de type II, augmentant la capacité de transport de l’épithélium Effet cytoprotecteur du KGF diminuant la perméabilité paracellulaire et/ou l’apoptose des cellules épithéliales Le KGF pourrait augmenter la transcription des protéines impliquées dans le transport alvéolaire du sodium: ENaC & NaKATPase - 4. Le KGF pourrait augmenter l’adressage des canaux de type ENaC à la membrane apicale des cellules, un processus rapide déjà observé après stimulation de l’AMP cyclique en hypoxie (J Biol Chem, 2002)

33 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
Engraftment Immunomodulation +++ Alveolar fluid clearance ++ Lung protein permeability Antibacterial properties

34 MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY
Upper compartment 131I-albumin Upper compartment lower compartment Human Alveolar Epithelial Type II Cells Lower compartment 0.4 M Microporous membrane Allogeneic Human Mesenchymal Stem Cells

35 MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY
Control + MSC Cytomix Permeability (%/24 h) + Fibroblast * A 

36 Absence d’effet du KGF sur la perméabilité épithéliale
Permeability (%/24 h) Control + MSC KGF (KGF siRNA) KGF+Ang-1 * *,  Cytomix 50 ng/ml

37 ROLE OF ANGIOPOIETIN-1 Les MSC sécrètent l’angiopoietin-1
Facteur de croissance vasculo-protecteur MSC transfectées avec AP-1  diminution des lésions vasculaires et des lésions pulmonaires modèle ALI souris (Mei et al., 2008) Permeability (%/24 h) Control + MSC Cytomix 50 ng/ml 5 10 15 + rhAng1 (Ang1 siRNA) * #  Contexte Il existe un papier montrant que l’angiopoietine 1 qui est vasculo protecteur est un facteur qui pourrait être impliqué dans l’effet des MSC dans l’ALI chez la souris. Les auteurs montrent qu’il existe une diminution des lésions et que les cytokines proinflammatoires sont diminués encore plus si les MSC sont transfectés avec de l’angiopoietine 1. Le mécansime n’est pas identifié Expériences réalisés in vitro sur des cellules humaines et mesure de la perméabilité epithéliales L’angio poietine 1 est responsible d’une diminution de la perméabilité induite par le cytomix. Fang et al. , J. Biol. Chem., 2010, 285, 26211 37

38 Les expériences montreront qui’il s’git d’un effet sur le maintien du cytosquelette d’actine et le maintien de la claudine 18 dans les jonctions serrées médié par la voie RAC

39 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
Engraftment -No Immunomodulation -Yes Alveolar fluid clearance -Yes Lung protein permeability - Yes Antibacterial properties ?

40 MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE: ANTIBACTERIAL PROPERTIES
1. Les MSC ont-elles un pouvoir antimicrobien: nombre et croissance de bactéries in vitro 2. Les MSC permettent-elles de limiter la croissance et d’augmenter la clairance des bactéries dans un modèle in vivo de pneumonie bactérienne Deux objectifs Etudier les propriétés antimicrobiennes des MSC en etudiant la croissance de bactéries gram positif: staphyloccoques auréus et bactéries gram négatif: escherichia coli et pseudomonas aeruginosa. Les principaux peptides antimicrobiens ont été etudies Evaluer le role des MSC en instillation intratrachéale sur la croissance et la clairance des bacteries dans les homogénats de poumons et dans le BAL fluid

41 MSC REDUCES BACTERIA COLONY FORMATION in vitro
Unstimulated MILIEU DE MSC DE MSC NON STIMULE PAR LES BACTERIES STIMULATED MILIEU DE MSC PREALABLEMENTSTIMULES PAR LES BACTERIES LE MILIEU CONDITIONNE EST PLUS EFFICACE QUE LE MILLIEU NON CONDITIONNE Les MSC sont infectés pendant 6H par E. Coli et le nombre de CFU est ensuite mesurés. Les CSM inhibe le nombre e CFU en culture. Les memes effets sont observés avec le milieu conditionné de CSM qui indique que cet effet est médié par un facteur soluble. Le milieu de culture des CSM a égélament un effet sur le nombre de colonies de P. Aeruginosa.

42 MSC REDUCES E. Coli COLONY FORMATION in vitro
 8 E. coli CFU (x 105 / ml) 6 * 4 2 Les MSC sont infectés pendant 6H par E. Coli et le nombre de CFU est ensuite mesurés. Les CSM inhibe le nombre e CFU en culture. Les memes effets sont observés avec le milieu conditionné de CSM qui indique que cet effet est médié par un facteur soluble. Le milieu de culture des CSM a égélament un effet sur le nombre de colonies de P. Aeruginosa. Les différents peptides antimicrobiens ont eté évalués beta defensines, lipocalins, SPD (mRNA proteines et elisa) mais restent inchangés Seul la cathelicidin LL-37 peptides antimicrobien est augmenté notamment lorsque les CSM ont préalablement été stimulées par E. Coli LL37 est la forme active du peptides antimicrobien cathelicidin et est obtenue par clivage par des protéinases. Il est libéré par des monocytes et PN et s’opposent aux actions du LPS et notamment aux effets chémoattractants poru les PN macro et monoyctes PBS MSC MSC+ anti-LL 37* Ab Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

43 Intravenous hMSC Reduce Mortality & Bacteremia in Mice when Administered 4 hours after Peritoneal Pseudomonas Sepsis 12 24 36 48 25 50 75 100 hMSC n=34 3T3 n=27 PBS n=42 Survival (%) * 1,000 2,000 3,000 4,000 3T3 (21) MSC (18) PBS (22)  Blood Bacterial Counts (CFU/ml) Time (h) MSC vs 3T3 < p 0.01 MSC vs PBS < p 0.01 MSC vs 3T3 p = 0.037, MSC vs PBS p = 0.005 Samarani et al, 2010

44 P.aeruginosa in blood (cfu/ml)
Severity of Sepsis: the rise in bacterial growth in blood is prevented by MSC treatment P.aeruginosa in blood (x 102 cfu/ml) Time (h) 400 800 8 12 MSC 3T3 PBS 10 100 3T3 MSC PBS ,√ P.aeruginosa in blood (cfu/ml) MSC vs 3T3 p MSC vs PBS p

45 Neutralization of LL-37 Activity Abolishes the
Antimicrobial Effect of MSC in vivo 106 105 105 104 E.coli CFU / ml in BAL E.coli CFU / ml in LH *   * 104 103 103 102 PBS +anti LL-37Ab + IgG MSC PBS +anti LL-37 Ab +IgG MSC MSC reduit le nombre de bactéries après 24H dans l’homogénat pulmonaire et dans le BAL fluid et donc augmente la clairance bactérienne. Fig. 8 Administration of MSC together with anti-LL37 neutralizing Ab (1 µg/mg), but not with mouse IgG abolishes improvement of bacterial clearance in lung homogenates (A) and BAL fluid (B), compared to MSC alone given mice. Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

46 MSC INCREASES PHAGOCYTIC ACTIVITY OF HOST IMMUNE CELLS
PBS MSC Phagocytosis (%) Phagocytic Index 10 20 30 40 50 100 ,√ RPMI E.coli cfu (x 106 /ml) in incubation medium 1 2 3 4 A B C Phagocytic activity of mouse peripheral blood monocytes

47 Alternative Activated (Type II) Macrophages
Critical role in host defense for resolution of inflammation and with a high phagocytic activity against bacteria. CD163 (haptoglobin-hemoglobin scavenger receptor) and CD206 (macrophage mannose receptor) are markers of type II macrophages. Recent data suggest that CD163 can function as a macrophage receptor for gram positive and gram negative bacteria (Blood, 2009) Contrast with TLRs which recognize soluble dissociated microbial components, not intact bacteria.

48 Immunofluorescence for CD163 on the slides of mouse spleen
MSC 3T3 PBS H&E staining of mouse spleen slides

49 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
Engraftment -No Immunomodulation – augmentation cytokines pro-inflammatoires Alveolar fluid clearance – role du KGF Lung protein permeability – role de l’angiopoietine Antibacterial properties- peptides anti microbiens Other mechanisms – microvesicules…..

50 Therapie cellulaire dans le SDRA?
Confirmation que les MSC ont un effet bénéfique dans des pathologies respiratoires Quels types cellulaires? Quand les administrer et pendant combien de temps? Quelle voie d’administration, IT, IV

51 Matthay et al. Chest, 2010