plan  Introduction  Définition  intérêt  Détermination de la séquence en acides aminés I. Préparation de la protéine pour le séquençage: II. Séquençage.

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2 plan  Introduction  Définition  intérêt  Détermination de la séquence en acides aminés I. Préparation de la protéine pour le séquençage: II. Séquençage des chaines polypeptidiques: III. Reconstitution de la séquence complète

3 Introduction: Rôles des protéines structure Acides aminés séquençage La chaine polypeptidique

4 Définition: La natureLe nombreL’ordre La stratégie de baseFrederick Sanger 1953 La première séquence: l’insuline

5 Intérêt du séquençage: Comprendre le mécanisme d’action au niveau moléculaire Comparaison des séquences de protéines analogues//fonctionnement Clinique, diagnostique des mutations

6 Détermination de la séquence en acides aminés : Préparation de la protéine pour le séquençage Séquençage des chaines polypeptidi- ques Reconstitution de la structure complète

7 I.Préparation de la protéine pour le séquençage: 1. Déterminer le nombre de chaines polypeptidiques: analyse des groupements terminaux insuline Résidus N terminaux Phe et Gly 2 types de ch polypep en nombre =

8 Identification des résidus Nterminaux:  Méthode de Sanger(FDNB)

9  Méthode des dansylaminoacides:

10  Méthode d’Edman:

11  Méthodes enzymatiques: exopeptidase ; aminopeptidase : hydrolysent séquentiellement les acides aminés depuis l’extrémité N-terminale d’un polypeptide

12 Identification des résidus C terminaux:  Hydrazinolyse: un polypeptide est traité par l’hydrazine anhydre à 90°C pendant 20 à 100 heures toutes les liaisons peptidiques sont rompues et tous les résidus sont transformés en hydrazides sauf le résidus C-terminale que l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre façile à isoler et à identifier par chromatographie

13 Identification des résidus C terminaux:  Hydrazinplyse: un polypeptide est traité par l’hydrazine anhydre à90°C pendant 20 à 100 heures toutes les liaisons peptidiques sont rompues et tous les résidus sont transformés en hydrazides sauf le résidus C-terminale que l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre facile à isoler et à identifier par chromatographie

14  Méthode enzymatiques : carboxypeptidase

15 2. Coupures des ponts disulfures: Réduction par le 2-mercaptoethanol:

16 3.Séparation purification des chaines polypeptidiques Milieu acide ou basique, C saline élevée, T° élevée Urée Ion Guanidinium SDS chromatographie

17 4.Détermination de la composition en acides aminés:

18 Hydrolyse des liaisons peptidiques: Hydrolyse acide Hydrolyse base Hydrolyse enzymatique Hcl 6M 100-120°C 24H Trp Gln Glu Asn Asp

19 hydrolyse basique NaOH 2-4M 100°C 4-8H Cys Ser Thr Arg

20 Hydrolyse enzymatiqu e déterminati on de: Trp Gln Asn un mélange de peptidase; pronase[1] (streptomyces griséus)

21 II.séquençage des chaines polypeptidiques: 1. Réaction d’hydrolyse spécifique: 2. Séparation purification des fragments: 3. Détermination de la séquence en AA des fragments:

22  Réaction d’hydrolyse spécifique: les fragments <40- 100AA ayant hydrolysés en petits fragments hydrolyse spécifique chimique,enz Bromure de cyanogène: après Met N- Bromosuccinimide HOBr:après Tyr Try HydroxylamineNH2 OH: hydrolyse les liaisons Asn-Gly

23  Réaction d’hydrolyse spécifique

24  Séparation purification des fragments: Dénaturant : Urée, SDS Support de CHromato HPLC Phase inverse

25 Détermination de la séquence en AA des fragments: les petits fragments cycles répétés (Edman ) dispositif automatiq

26 Reconstitution de la séquence complète : Mise en ordre des fragments

27 LABORATOIRE DE BIOCHIMIE CHU CNE  Dr. BENDJAZIA  MCB. ALLOUI. AS 2016