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Licence pro QSR2A TOXICOLOGIE Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction 1.Les mycotoxines 2.Les substances antimicrobiennes.

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1 Licence pro QSR2A TOXICOLOGIE Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction 1.Les mycotoxines 2.Les substances antimicrobiennes 3.Les pesticides 4.Les composés N-nitrosés 5.Les métaux lourds

2 2. Les substances antimicrobiennes 2.1. Définitions Antibiotique Désinfectant Antiseptique 2.2. Causes de leur présence dans les aliments

3 2. Les substances antimicrobiennes 2.3. Conséquences sur la santé du consommateur 2.4. Conséquences industrielles

4 2. Les substances antimicrobiennes 2.5. Détection par méthode microbiologique Dans les viandes et les produits daquaculture : Léchantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un micro- organisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de micro-organismes de lordre de 10 4 /ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme. Si léchantillon contient des traces dantibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou inhibée du micro-organisme test autour de léchantillon. Le résultat est donné par la taille des zones dinhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans léchantillon. Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre et de 2 cm de long est prélevée à laide dun emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont découpées à partir de cette carotte. Les rondelles déchantillons sont réparties à la périphérie des boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles dun même échantillon sont déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet danalyser simultanément trois échantillons. Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution dantibiotiques de référence correspondant (témoin positif). Les échantillons positifs (cest-à-dire avec présence de traces dantibiotiques dans léchantillon) sont ceux qui donnent une zone dinhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

5 2. Les substances antimicrobiennes 2.5. Détection par méthode microbiologique Dans les viandes et les produits daquaculture :

6 2. Les substances antimicrobiennes 2.5. Détection par méthode microbiologique Dans le lait : étape de dépistage par méthode dacidification Le principe des tests dacidification est de détecter la présence de traces dantibiotiques par lévolution du changement de couleur dun indicateur de pH, due à la croissance dun micro- organisme spécifié. Si léchantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du micro- organisme est inhibée ou ralentie et lindicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu dantibiotique. La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus. Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusquau lendemain au plus tard ou congelés pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture dépreuve contenant le micro-organisme de référence et lindicateur de pH (pourpre de bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC, par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif. Résultats des témoins :Résultats des essais : (+) (-)

7 2. Les substances antimicrobiennes 2.5. Détection par méthode microbiologique Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon présente une zone dinhibition de 10 mm minimum, le résultat est positif (cest-à-dire quil y a présence de traces dantibiotiques dans léchantillon). Les témoins positifs doivent présenter une zone dinhibition dau moins 12 mm.

8 2. Les substances antimicrobiennes 2.5. Détection par méthode microbiologique Dans le lait : méthode officielle de linterprofession laitière Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme indicateur de pH (principe du test dacidification). On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin négatif et un témoin positif. Lincubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique. Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats avec ceux obtenus par dautres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et inter-laboratoires). Dans tous les cas, pour compenser lexcès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés. Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection dun large spectre de résidus dantibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas lidentification précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée dantibiotiques.

9 2. Les substances antimicrobiennes

10 2.6. Titrage par méthode microbiologique

11 2. Les substances antimicrobiennes 2.6. Titrage par méthode microbiologique

12 2. Les substances antimicrobiennes 2.7. Autres méthodes Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse (recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM, sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM). Jusquà une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient pas systématiquement lobjet danalyses complémentaires de confirmation (identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus dantibiotiques soit en conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90 relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. Cest ainsi quil est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un premier temps, un essai didentification et quantification des antibiotiques responsables dun résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen dune méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire national de référence. Aujourdhui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto (les professionnels de la filière laitière parlent « dinhibiteurs », naturels ou non), alors que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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