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CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES Master 2 BCPP Épithéliums structures dinterface Université Paris Diderot Christine Clerici.

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1 CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES Master 2 BCPP Épithéliums structures dinterface Université Paris Diderot Christine Clerici U700 – CRB3 UFR de Médecine Paris Diderot

2 MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE MSC et greffe tissulaire : régénération des tissus - réparation cardiaque - ostéogénèse imparfaite MSC et propriétés immuno-modulatrices - traitement de la GVH - insuffisance rénale - hépatite - diabète

3 MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE et PATHOLOGIES PULMONAIRES MSC et greffe tissulaire : fusion ou repopulation? -Poumon sain (Krause, 2001) -Fibrose pulmonaire à la bléomycine (Ortiz, 2003; Kotton, 2004) -Poumon radique (Theise, 2002) -Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009) MSC et propriétés immuno-modulatrices -Fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (Ortiz, 2007) -Fibrose pulmonaire induite par la silice (Lassance, 2009) -Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009; Aslam, 2009) MSC vecteurs thérapeutiques

4 MSC et Syndrome de détresse respiratoire aiguë

5 Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Efficaces dans le SDRA Glucocorticoids Surfactant therapy Lisofylline Ketoconazole Inhaled nitric oxide Procysteine Neutrophil elastase inhibitor Activated Protein C

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7 Quels effets des MSC dans des modèles pré-cliniques de lésions inflammatoires alvéolaires aiguës ? 1. MSC et ALI dans des modèles animaux – Effets de CSM in vivo dans un modèle doedème alvéolaire induit par lendotoxine chez la souris – Effets des CSM in vivo dans un modèle de VILI chez la souris – Effets des CSM in vivo dans un modèle de pneumopathie bactérienne 2. MSC et ALI dans un modèle de poumon humain : études in vitro et in vivo

8 Hours 48 h Survival (%) PBS (n = 31) MSC (n = 30) ** **p < 0.01 GUPTA ET AL, J IMMUNOLOGY, 2007 EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND LUNG HISTOLOGY IN MICE AFTER LPS E. COLI E.C OLI IT prélèvementsMSC IT +4H +24/48H 0

9 PBS Excess Lung Water (µl) **p= MSC ** MSC PBS **p=0.005 BAL Protein (mg/L) ** MSC REDUCES PULMONARY EDEMA AND BAL PROTEIN IN MICE AFTER LPS

10 PBS (n = 13) MSC (n = 11) hours 48 h Survival (%) * A PBS MSC 48 h Excess Lung Water (µl) * B EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND PULMONARY EDEMA IN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA Gupta et al, unpublished data, 2009 E.C OLI 10 6 CFU IT prélèvementsMSC IT +4H +24/48H 0

11 EFFECT OF MSC ON BACTERIA GROWTH IN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA Krasnodembskaya, Stem Cells, 2010

12 MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.

13 Curley G F et al. Thorax 2012;67:

14 MSC THERAPY MODULATES THE INFLAMMATORY RESPONSE TO VILI. Curley G F et al. Thorax 2012;67:

15 Lee JW et al, PNAS, 2009 EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN

16 1 h - Right or left lung selected, surgical preparation - Begin perfusion without blood 1 h 4 h - Lung Temp 36°C -Apply 10 cm H 2 0 CPAP (95% O 2 & 5% CO 2 ) - Measure AFC over 1 h in RUL (Control) - If AFC >10%/h in RUL, Add 100 ml Fresh Whole Blood to Perfusate Instill 0.1 mg/kg of endotoxin into the airspaces of the RML - Measure AFC over 1 h in RML (endotoxin) Instill 5 x 10 allogeneic human mesenchymal stem cells or MSC conditioned medium to RML 6 1 h EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN

17 Control Lung Lobe LPS Lung Lobe LPS + MSC Lung Lobe LPS + MSC CM Lung Lobe 8 ± 5 x 10 cells 6 25 ± 25 x 10 cells 6 13 ± 11 x 10 cells 6 6 ± 5 x 10 cells 6 Absolute Neutrophil Counts P < Lee, PNAS, 2009

18 Control LPS LPS + MSC Endothelial Permeability (%) LPS + MSC CM * ControlLPSLPS + MSC Wed/Dry Ratio LPS + MSC CM * * AB EFFECT OF MSC ON ENDOTHELIAL PERMEABILITY AND PULMONARY EDEMA IN HUMAN LUNG INJURED BY LPS

19 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS Engraftment Immunomodulation Alveolar fluid clearance Lung protein permeability Antibacterial properties No, < 5%, Gupta et al., 2007

20 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ALI IN MICE : IMMUNOMODULATION No cell contact : MSC secretion of soluble factors – modulation by the inflammatory environment? Cell-cell contact : Interaction with other inflammatory cells, leukocytes, macrophages…. Candidate mediators released or induced by MSC -TGF- -TNF induced protein (TSG 6) -PGE 2 -IL-10 -IL-1ra …..

21 MSC PBS MIP-2 BAL (pg/ml) TNF-α BAL (pg/ml) MSC PBS ** MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMUNOMODULATION Gupta et al., 2007 ALI - endotoxin ALI Pneumonia E. Coli Krasnodembskaya, 2010

22 PBSMSC 8 h BAL IL-10 (pg/ml) * PBS MSC h BAL IL-10 (pg/ml) 24 h Plasma IL-10 (pg/ml) PBSMSC * MSC Upregulate Production of anti-inflammatory cytokines in Endotoxin Induced Lung Injury in Mice

23 Nemeth et al, Nat Med, 2009 (ALI dans un modèle de sepsis par LC)

24 Nemeth et al. Nat Med,2009 MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMODULATION BY CELL-CELL INTERACTION

25 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS Engraftment Immunomodulation +++ Alveolar fluid clearance Lung protein permeability Antibacterial properties

26 Alveolar Fluid Clearance (%/h) ControlMSC MSC CM Normal Lung Fibroblasts * * LPS * P< vs. Control P< vs. LPS (0.1 mg/kg) MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN HUMAN LUNG: ALVEOLAR FLUID CLEARANCE

27 MSC induced increase in Na-dependent AFC Alveolar Fluid Clearance (%/h) + MSC CM + 5 x 10 M Amiloride LPS * Data as mean ± SD, * P < 0.05 Lee JW et al, PNAS, 2009

28 64 kDa ENaC Apical Membrane % of Control + MSCControl Cytomix 50 ng/ml * Cytomix 50 ng/ml Control +MSC * * 85 kDa GAPDH * * * ENaC Total Cell Lysis % of Control

29 Quels facteurs paracrines susceptibles daméliorer la clairance alvéolaire ? Diminution des cytokines pro-inflammatoires et augmentation des cytokines anti-inflammatoires dans le modèle ALI souris mais pas dans le modèle poumon humain. Sécrétion de facteurs de croissance, KGF, angiopoietine-1 qui sont connus pour réduire les lésions pulmonaires dans les œdèmes lésionnels : bléomycine, VILI, hyperoxie, HCl, pneumopathie bactérienne.

30 MSC sécrètent des facteurs de croissance concentration (pg/ml) Control Cytomix * concentration (pg/ml) Control Cytomix +3%O 2 * KGF Angiopoietin-1

31 Alveolar Fluid Clearance (%/hr) * P<0.001 vs. Control P<0.03 vs. LPS (0.1 mg/kg) ControlLPS LPS + CM MSC LPS + CM MSC (KGF siRNA) *, # # P<0.01 vs. LPS + CM MSC (KGF siRNA) rhKGF (100ng) *, MSC IMPROVED ALVEOLAR FLUID CLEARANCE IN HUMAN LUNG: ROLE OF KGF

32 Mécanismes responsables de la restauration de la clairance alvéolaire par le KGF 1.Effet mitogène sur les cellules alvéolaires de type II, augmentant la capacité de transport de lépithélium 2.Effet cytoprotecteur du KGF diminuant la perméabilité paracellulaire et/ou lapoptose des cellules épithéliales 3.Le KGF pourrait augmenter la transcription des protéines impliquées dans le transport alvéolaire du sodium: ENaC & NaKATPase - 4. Le KGF pourrait augmenter ladressage des canaux de type ENaC à la membrane apicale des cellules, un processus rapide déjà observé après stimulation de lAMP cyclique en hypoxie (J Biol Chem, 2002)

33 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS Engraftment Immunomodulation +++ Alveolar fluid clearance ++ Lung protein permeability Antibacterial properties

34 Upper compartment lower compartment Upper compartment Lower compartment 131 I-albumin Human Alveolar Epithelial Type II Cells 0.4 M Microporous membrane Allogeneic Human Mesenchymal Stem Cells MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY

35 Control + MSC Cytomix Permeability (%/24 h) + Fibroblast * A * MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY

36 Permeability (%/24 h) Control + MSC KGF + MSC (KGF siRNA) KGF+Ang-1 * * *, * Cytomix 50 ng/ml Absence deffet du KGF sur la perméabilité épithéliale

37 Permeability (%/24 h) Control+ MSC Cytomix 50 ng/ml rhAng1 + MSC (Ang1 siRNA) * * # ROLE OF ANGIOPOIETIN-1 Fang et al., J. Biol. Chem., 2010, 285, Les MSC sécrètent langiopoietin-1 Facteur de croissance vasculo- protecteur MSC transfectées avec AP-1 diminution des lésions vasculaires et des lésions pulmonaires modèle ALI souris (Mei et al., 2008)

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39 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS Engraftment -No Immunomodulation -Yes Alveolar fluid clearance -Yes Lung protein permeability - Yes Antibacterial properties ?

40 1. Les MSC ont-elles un pouvoir antimicrobien: nombre et croissance de bactéries in vitro 2. Les MSC permettent-elles de limiter la croissance et daugmenter la clairance des bactéries dans un modèle in vivo de pneumonie bactérienne MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE: ANTIBACTERIAL PROPERTIES

41 MSC REDUCES BACTERIA COLONY FORMATION in vitro

42 MSC REDUCES E. Coli COLONY FORMATION in vitro PBS MSC MSC+ anti-LL 37* Ab E. coli CFU (x 10 5 / ml) * Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

43 Time (h) Intravenous hMSC Reduce Mortality & Bacteremia in Mice when Administered 4 hours after Peritoneal Pseudomonas Sepsis MSC vs 3T3 p = 0.037, MSC vs PBS p = ,000 2,000 3,000 4,000 3T3 (21) MSC (18) PBS (22) Blood Bacterial Counts(CFU/ml) MSC vs 3T3 < p 0.01 MSC vs PBS < p 0.01 Samarani et al, 2010

44 T3MSCPBS, P.aeruginosa in blood (cfu/ml) Severity of Sepsis: the rise in bacterial growth in blood is prevented by MSC treatment MSC vs 3T3 p MSC vs PBS p

45 PBS +anti LL-37 Ab +IgG E.coli CFU / ml in BAL E.coli CFU / ml in LH PBS +anti LL- 37Ab + IgG MSC * * Neutralization of LL-37 Activity Abolishes the Antimicrobial Effect of MSC in vivo Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

46 3T3PBSMSC 3T3PBSMSC Phagocytosis (%) Phagocytic Index , 0 RPMI E.coli cfu (x 10 6 /ml) in incubation medium T3PBSMSC A B C,, Phagocytic activity of mouse peripheral blood monocytes MSC INCREASES PHAGOCYTIC ACTIVITY OF HOST IMMUNE CELLS

47 Alternative Activated (Type II) Macrophages Critical role in host defense for resolution of inflammation and with a high phagocytic activity against bacteria. CD163 (haptoglobin-hemoglobin scavenger receptor) and CD206 (macrophage mannose receptor) are markers of type II macrophages. Recent data suggest that CD163 can function as a macrophage receptor for gram positive and gram negative bacteria (Blood, 2009) Contrast with TLRs which recognize soluble dissociated microbial components, not intact bacteria.

48 3T33T3 MSC PBS Immunofluorescence for CD163 on the slides of mouse spleen H&E staining of mouse spleen slides

49 HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS Engraftment -No Immunomodulation – augmentation cytokines pro- inflammatoires Alveolar fluid clearance – role du KGF Lung protein permeability – role de langiopoietine Antibacterial properties- peptides anti microbiens Other mechanisms – microvesicules…..

50 Therapie cellulaire dans le SDRA? Confirmation que les MSC ont un effet bénéfique dans des pathologies respiratoires Quels types cellulaires? Quand les administrer et pendant combien de temps? Quelle voie dadministration, IT, IV

51 Matthay et al. Chest, 2010


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