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Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot.

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1 Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

2 INTRODUCTION Quest-ce qui caractérise une cellule ? -les gènes exprimés -leur niveau dexpression Les mécanismes moléculaires à lorigine de tous les processus biologiques normaux et pathologiques passent par des modifications quantitatives et qualitatives des ARN et des protéines. Méthodes permettant de repérer et didentifier les ARN et les protéines dont la quantité varie

3 La régulation de lexpression des gènes chez les organismes eucaryotes

4 Définitions Protéome : ensemble des protéines présentes dans une cellule ou un tissu Transcriptome : ensemble des ARN présents dans une cellule ou un tissu Transcrit ou Protéine différentielle : Transcrit ou Protéine dont la quantité est modifiée ( ou )

5 Historique des techniques danalyse des transcrits différentiels Technologies appliquées aux ADNc Techniques danalyse des transcrits différentiels dérivées Caractéristique de lanalyse Années 80 Banques dADN complémentaires Banques soustractives Qualitative Non exhaustive Années 90 PCR -Differential Display, CDNA-AFLP -RDA -SSH Qualitative Non exhaustive Facile à réaliser Fin années 90 Séquençage systématique : -de génomes entiers -de séquences exprimées (EST) Bio-informatique Microtechniques appliquées à la biologie moléculaire -SAGE -microarrays puces à ADN (« DNA chips ») Quantitative « exhaustive » lourde et onéreuse

6 Cellules A ARNm A ADNc A Cellules B ARNm B ADNc B BANQUE SOUSTRACTIVE dNTP-Biotine Hybridation A /AA /BB /B Banque soustractive A-B Elimination des ADNc portant de la biotine

7 Méthodes danalyses des transcrits différentiels A PETITE ECHELLE mRNA Differential Display PCR soustractive : Representational Difference Analysis (RDA) Subtractive Suppressive Hybridization (SSH) Arrays sur membrane

8 mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY CMAAAAAAAAA-An GMTTTTTT AGCCAGCGAA GMTTTTTT AGCCAGCGAA GMTTTTTT AGCCAGCGAA Transcription inverse Amplification par PCR 5-TTTTTTTTTTTTMG-3 (T12MG) dNTPs Transcriptase inverse 5-AGCCAGCGAA-3 (amorce AP1) 5-TTTTTTTTTTTTMG-3 (T12MG) dNTPs -( 35 S-dATP) ou -( 33 P-dATP) Taq polymerase

9 ADNc A Cellules B ARNm B ADNc B Electrophorèse (polyacrylamide) mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY Analyse des ADNc positifs potentiels (clonage, élimination des « faux positifs ») AB Autoradiographie Bande « positive » Extraction des bandes « positives » du gel PCR RT (oligodT ancré) TTTTTTT AAAAAAAAAAA PCR (oligodT/amorce aléatoire) dATP-S 35 AAAAAAAAAAA TTTTTTT AGCCAGCAA Cellules A ARNm A RT (oligodT ancré) TTTTTTT AAAAAAAAAAA PCR (oligodT/amorce aléatoire) dATP-S 35 AAAAAAAAAAA TTTTTTT AGCCAGCAA

10 Autoradiogramme de Differential Display Comparaison des cellules A et B A B

11 mRNA Differential Display Nombre doligonucléotides et de PCR possibles - Transcription inverse T AA TTTTTTTTTTTTCC GG 3 possibilités4 possibilités 12 oligonulcéotides différents - PCR Primer 3 (T12MX) : 12 possibilités Primer 5 (10-mers) : 16 possibilités Nombre de PCR différentes possibles par échantillon : 12 x 16 = 192 Pour 2 échantillons : 192 x 2 = 384 PCR Pour 2 échantillons, PCR en duplicat ou triplicat : 768 ou 1152 PCR !!!

12 Autoradiogramme de Differential Display Induced Constant Comparaisons Contrôle et échantillon : C / E2 (3 PCR différentes pour C et 3 PCR différentes pour E2)

13 Avantages du mRNA Differential Diplay Peu dARN nécessaire Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes : - faiblement exprimés (en principe) - inconnus -soumis à épissage alternatif Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…) Mise en évidence de régulation positive et négative Facile à mettre en œuvre Très rapide Peu onéreux

14 Inconvénients du mRNA Differential Diplay Non exhaustif -compatibilité avec les oligonucléotides de PCR -Taille des produits de PCR ne doit pas excéder 500 pb Biais de la PCR : Grand nombre de « faux positifs » température dannealing trop basse PCR manque de reproductibilité Elimination des faux positifs longue et fastidieuse Amplification préférentielle de certains ADNc - Réduction de la complexité des ADNc - Représentation de chaque type dADNc très différente de celle des ARNm dont ils sont issus Identification des ADNc pas toujours facile (dépend de lespèce)

15 Electrophorèse (polyacrylamide) AB Autoradiographie Bande « positive » Digestion enzymatique Cellules A ARNm A ADNc A Ligation dadaptateurs Cellules B ARNm B ADNc B PCR cDNA - AFLP

16 Principe général des techniques de PCR soustractives (RDA & SSH) Hybridation PCR suppressive A - B Sous-clonage Banque soustractive A - B A/A A/B B/B Pas damplification Amplification linéaire Amplification exponentielle Digestion enzymatique Cellules A ARNm A ADNc A Ligation dadaptateurs PCR Cellules B ARNm B ADNc B Digestion enzymatique

17 REPRESENTATIONAL DIFFERENCE ANALYSIS (RDA)

18 SUBTRACTIVE SUPPRESSIVE HYBRIDIZATION (SSH) Banque soustractive A - B

19 Avantages de la RDA et de la SSH Peu dARN nécessaire Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes : - faiblement exprimés (SSH surtout) - inconnus -soumis à épissage alternatif Identification facile des cDNA Assez facile à mettre en œuvre Rapide Peu onéreux

20 Inconvénients de la RDA et de la SSH Comparaison simultanée de plusieurs échantillons difficile Non exhaustif Les cDNA doivent avoir un minimum de 2 sites de restriction pour générer des produits amplifiables. Fabrication de 2 banques soustractives pour voir les gènes induits ET réprimés Biais de la PCR : Amplification préférentielle de certains ADNc - Réduction de la complexité des ADNc - Détection préférentielle des transcrits différentiels abondants -Faux positifs

21 MACROARRAYS ADNc « positif » indétectable

22 MACROARRAYS Analyse de lexpression de 96 gènes au cous du cycle cellulaire dune lignée synchronisée GA G1/S G1 G2 NS Cellules non synchronisées (NS), en arrêt de croissance (GA), en phases G1, G1/S et G2 du cycle cellulaire.

23 Avantages des macroarrays Peu dARN nécessaire Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…) Choix du matériel à spotter sur les membranes : -produits de PCR : RT-PCR, plasmides ou lysats bactériens amplifiés -clones bactériens : issus de banques dADNc, de banques soustractives Assez facile à mettre en œuvre (automatisation possible)

24 Inconvénients des macroarrays Non exhaustif Préparation des membranes peut être longue Attention à la qualité du matériel spotté Cross-hybridation (faux négatifs)

25 Microarrays sur Nylon 8000 gènes

26 Méthodes danalyses des transcrits différentiels A GRANDE ECHELLE Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Microarrays sur lames, DNA chips (puces à ADN)

27 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

28 SERIAL ANALYSIS OF GENES EXPRESSION (SAGE) TTTTTT AAAAAA TTTTTT AAAAAA A TTTTTT AAAAAA B B A ARNm Transcription inverse sur bille Digestion par l enzyme d ancrage Ligation dadaptateurs (A ou B) Digestion par lenzyme d étiquettage Digestion (bouts francs) Ligation Amplification par PCR Digestion, Concaténattion Clonage, Séquençage B A

29 SAGE

30 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNAATAAANNNNNNNNNNNNNAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3 CATGNNNNNNNNNN : 14 pb 4 pb site de restriction pour NlaIII + 10 pb étiquette (TAG) spécifique ADNc complet 5

31 SAGE : analyse des résultats NB : La qualité des résultats dépend du nombre de Tags séquencés 1-Précision du SAGE: Echantillonnage de Tags statistiquement représentatif de la totalité du transcriptome : Tags ->Quantitatif En-dessous de Tags les quantités relatives calculées de chaque transcrit ne sont pas constantes (pour 1000, 1500, 2000 Tags) -> seulement semi-quantitatif 2-Sensibilité du SAGE : dépend du nombre de Tags séquencés (résultats moins fiables pour les transcrits rares) Compilation des résultats de séquençage Calcul de la fréquence dapparition Séquençage en série

32 Avantages du SAGE ~ Exhaustif Bilan transcriptionnel Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes : - faiblement exprimés (limite en fonction du nombre de tags séquencés) -Inconnus Mise en évidence de régulation positive et négative Construction de bases de données de SAGE

33 Inconvénients du SAGE Techniquement difficile à mettre en œuvre Haute capacité de séquençage nécessaire Long et onéreux Identification des ADNc pas toujours facile - Attention aux erreurs de séquençage (des Tags de SAGE et des bases de données) - Identification très difficile pour les espèces « exotiques » - Comparaison dun grand nombre déchantillon difficile Initialement beaucoup dARN nécessaire Optimisation MicroSAGE, SADE Biais de la PCR : - Amplification préférentielle de certains ADNc (même avec des amplicons de taille identique) - Modification de la représentation de chaque type dADNc par rapport à celle des ARNm dont ils sont issus - Parfois grand nombre de Ditags identiques : artefacts


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