La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Gain de fonction, perte de fonction. hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire Puce à ADN Discovery-driven research Comparaison.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Gain de fonction, perte de fonction. hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire Puce à ADN Discovery-driven research Comparaison."— Transcription de la présentation:

1 Gain de fonction, perte de fonction

2 hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire Puce à ADN Discovery-driven research Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente gène x = candidat

3 Sur-expression Gain de fonction Sous-expression Perte de fonction expression physiologique 24 h après Produit de gène x

4 Gain de fonction Organisme Cellule perte de fonction sous-expression Knock Out sur-expression Transgénique

5 Sur-expression expression physiologique Produit de gene x = protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Approche : Gain de fonction protéine x macromolécule informationnelle

6 protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x transcription traduction

7 ? - Source de la macromolécule informationnelle ? - Introduction dans la cellule

8 Source de la macromolécule informationnelle Purifiée à partir d’une source biologique Protéine recombinante ADN ARN Protéine PCR, Clonage Transcription in vitro

9 Plasmide Promoteur d’ARN polymérase de bactériophage recombinant ADN codant protéine x

10 recombinant Transcription in vitro Plasmide ARN polymérase de bactériophage ARN

11 Protéine recombinante Escherichia coli Transfection Extraction et purification Protéine x Plasmide ADN codant protéine x recombinant Promoteur bactérien

12 Introduction dans la cellule Transfection * Transformation * Transduction * Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus. Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule. Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène.

13 La membrane plasmique est une barrière physique à la transfection de protéines et acides nucléiques

14 Lipopolysaccharides peptidoglycan Membrane Plasmique intérieur peptidoglycan Membrane Plasmique extérieur Périplasme lipoprotéine Porine (protéine) Transporteur (protéine) Paroi bactérien (gram -)

15 Paroi de lévure

16 Paroi d’une cellule végétale Paroi pectocellulosique Membrane plasmique

17 Digestion enzymatique protoplaste Cellule végétale Production de protoplastes

18 Digestion enzymatique Production de sphéroplastes levure sphéroplaste

19 Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Fusion membranaire

20 - Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc - Endocytose - Fusion membranaire

21 Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - artificielle - biologique - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

22 Micro-injection : artificielle

23 Avantages : transfection très efficace Inconvénients : lourdeur technique transfection de populations de cellules impossible

24 Micro-injection : biologique : bactéries Pilus F Bactériophage M13 M13 T7T7 Bactériophage T7

25 Agrobacterium tumefaciens galles Micro-injection : biologique : cellules végétales

26 Agrobacterium : cycle de vie

27

28 Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

29 CaCl 2 Cl - Ca ++ LiCH 3 CO 2 Li + CH 3 CO 2 - Choc-osmotique/choc-thermique bactérie levure 37°C 42°C perméabilisation ADN H2OH2O turgescence

30 Avantage : Inconvenients : Peu onéreuse transfection de populations de cellules toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules Choc-osmotique/choc-thermique faible efficacité

31 Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

32 kV/cm  s Electroporation

33 Interrupteur # 1 Interrupteur # 2 résistance alimentation capacitance

34 Electroporation Avantage : Inconvenients : efficacité de transfection transfection de populations de cellules toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules

35 transfectées Rupture de la hélium Onde de choc Biolistique …… membrane calibrée Capsule à microbilles Grille de rétention cellules microbilles en or hélium

36 Biolistique

37 Avantage : Inconvenients : Utilisation avec cellules à paroi transfection de populations de cellules Endommage les cellules Transfection peu uniforme

38 Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

39 Avantage : Inconvenients : Technique trop récente ? ?

40 Agrolistique

41 Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Fusion membranaire

42 Endocytose L’endocytose implique la capture spécifique de macromolécules ou nanoparticules par la membrane plasmique

43 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

44 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

45 Peptides passe-membranes (cell-penetrating peptides : CPP) -de la protéine antennapaedia -de la protéine tat de VIH - oligo arginine R Q I K I W F Q N R R M K W K K G R K K R R Q R R R P P Q C R R R R R R R R R Peptides cationiques Endocytose :

46 cargo CPP (conjugaison chimique) CPP (peptide de synthèse) conjugaison chimique (liaison covalente) Protéine ARN ADN G R K K R R Q R R R P P Q C

47 ADN codant protéine x ADN codant CPP Transfection dans E.coli RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x Plasmide recombinant CPP ( protéine de fusion recombinante )

48 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

49 Phosphate de calcium 3 CaCl Na 3 PO 4 Ca 3 PO 4 + 6NaCl nanoparticules endosome Précipitée Ca 3 PO 4 / ADN nanoparticulaire Membrane plasmique ADN ARN Protéine ? Endocytose :

50 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

51 Polymères ramifiés Polyéthylénimine (PEI) Complexe PEI / ADN nanoparticulaire ADN ARN Protéine ? Endocytose :

52 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

53 lipides amphipathiques région cationique région lipidique (hydrophobe) Lipoplexe (nanoparticule) example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Endocytose :

54 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

55 +-+ p pppp K E T W W E T W W T E W S Q P K K K R K V C p Pep-1 Endocytose : peptides amphipathiques N O O O O C C région cationique région hydrophobe

56 Nanoparticule de Pep-1/cargo (protéine) Endocytose : peptides amphipathiques

57 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

58 ADN ARN Protéine Endocytose : nanoparticules hydrophobes Lipofection

59 Nanoparticules - molécules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés Endocytose - lipides - peptides Macromolécules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus

60 recepteur membranaire nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus

61 Les virus Génome ADN ARN db sb Famille sb+ sb- Poxviridae Herpesviridae Rhabdoviridae Coronaviridae Adenoviridae Picornaviridae Parvoviridae Filoviridae Retroviridae Réoviridae

62 Les virus Génome ADN ARN db sb Famille sb+ sb- Poxviridae Herpesviridae Rhabdoviridae Coronaviridae Adenoviridae Picornaviridae Parvoviridae Filoviridae Retroviridae Réoviridae

63 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus Ligands de protéines membranaires :

64 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus

65 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus

66 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus = réplication incompétente E1 déleté

67 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus transgène

68 Cellules transformées par E1 promoteur  E1 genome avec transgène plasmide réplication incompétente transgènique virus transfection

69 Adenoviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus Avantages : transduction très efficace grande tropisme Inconvénients : Expression transitoire Sécurité

70 Les virus Génome ADN ARN db sb Famille sb+ sb- Poxviridae Herpesviridae Rhabdoviridae Coronaviridae Adenoviridae Picornaviridae Parvoviridae Filoviridae Retroviridae Réoviridae

71 Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Retroviridae

72 Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Retroviridae

73

74

75 retroviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

76 retroviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

77 Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Retroviridae

78

79 retroviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

80 rétrovirus : défective pour la réplication retroviridae nanoparticules : Endocytose : ligands membranaires :virus

81 Plasmide LTR Plasmide gag/pol env transfection Cellule productrice

82

83 Recombinaison pendant transcription inverse U3RU5 U3RU5 transgene 3’ LTR inactive U3RU5 U3RU5 transgene 5’ LTR auto-inactivé promoteur

84 Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

85 Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

86 HIS HHHHHH c-MYC EQKLISEEDL HA YPYDVPDYA VSV-G YTDIEMNRLGK HSV QPELAPEDPED V5 GKPIPNPLLGLDST FLAG DYKDDDDK étiquetage (epitope tagging) Plasmide ADN codant étiquette ADN codant Protéine x promoteur

87 Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

88

89 Etiquetage Green Fluorescent Protéine (GFP)dsRED

90

91

92

93 Co-marquage co-transfection co-traduction (IRES)

94 mTrim17 Pcmv his6 SV40 polyA ires YFP  his6  YFP 

95 expression transitoire ou expression stable

96 expression transitoire

97 expression stable Nécessite une intégration génomique rétrovirus intégration fortuite Événement rare sélection

98 promoteur 1promoteur 2 ADN x polyA Gene de résistance antibiotique

99 expression inductible tTA-NLSP CMV SV40 polyA P CMVmin tetO Gene x Tet repressor/TA doxycycline

100 expression inductible rtTA-NLSP CMV SV40 polyA P CMVmin tetO Gene x Reverse Tet repressor/TA doxycycline


Télécharger ppt "Gain de fonction, perte de fonction. hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire Puce à ADN Discovery-driven research Comparaison."

Présentations similaires


Annonces Google