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Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur.

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1 Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur Jacques MALLET Lahouari AMAR

2 Le transfert de gène dans le SNC Les vecteurs lentiviraux - caractéristiques - avantages et méthode de production - applications Résultats Développement dun seul vecteur lentiviral pour: 1) lexpression régulée dun facteur protéique 2) lexpression régulée de shARN Conclusion générale et perspectives

3 Transfert de gène dans le SNC Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN) In vivo Ex vivo Cellules transduites

4 Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de gène Présence de la barrière hématoencéphalique –Limite le passage de molécules thérapeutiques »Nécessité du transfert de gène… La majorité des cellules du SN sont quiescentes –Possibilité dutilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux –Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme »préférentiellement viral… Diversité cellulaire –Nécessité dexpression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique –Possibilité de ciblage dune structure ou noyau particulier dans le SN –Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones » avec un vecteur dont le tropisme est modulable. Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés

5 Avantages des vecteurs lentiviraux Transduction des cellules quiescentes et en division Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC Faible toxicité Facilité de production à haut titre dénuée de RCR Pseudotypage aisé

6 Vecteurs lentiviraux : méthode de production Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G) VSV-G P hCMV VSV-GpA Plasmide denveloppe Plasmide transcomplémentant P hCMV pA gag Pro pol Ψ rev tat Plasmide vecteur 5LTR 3LTR RREcPPT Pro Transgène U3 PPT Ψ WPRE

7 Applications des vecteurs lentiviraux Thérapie génique Production danimaux transgéniques (modèles de maladies…) Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)

8 Nécessité dun système régulable Etudes cliniques –Moduler lexpression du facteur thérapeutique –Arrêt du traitement en cas de complication grave Etudes fondamentales –Contrôle temporel du transgène –Contrôle du niveau dexpression

9 Le système de régulation inductible par la Tetracycline (Tet-on) PGK rTetR VP16 rtTA Tet + rTetR VP16 Tet 7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène

10 1. Développement dun seul vecteur lentiviral pour lexpression régulée dune protéine thérapeutique

11 Nécessité dun vecteur unique Réduction de la quantité de vecteur administrée: –Réduction du risque de mutagenèse insertionnelle –Réduction du risque dimmunogénicité lié au vecteur Permettre lexpression du transgène et du transactivateur dans la même cellule

12 Un vecteur lentiviral unique pour lexpression régulée dun transgène 5LTR 3LTR cPPT P cmv min Transgène U3 PPT Ψ WPRE Ins Stuffer P PGK rtTA2-M2 BGH polyA - Luciférase - Tyrosine hydroxylase

13 Expression régulée de la luciférase in vitro Transduction dune culture primaire dastrocytes + Dox - Dox

14 Réversibilité in vitroDose optimale in vitro Effet de la doxycycline sur lactivité luciférase Cinétique dinduction in vitro

15 Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le striatum de rat + Dox - Dox

16 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase + Dox- Dox Evaluation in vitro

17 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase Evaluation in vivo + Dox- Dox Contrôle non injecté

18 Résumé Construction dun seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on Validation in vitro et in vivo Niveau dinduction fort Fuite non détectable en absence dinducteur Dose dinducteur élevée in vivo

19 Applications, limites et voies damélioration Application de ce vecteur Tet-on Utilisation in vitro Utilisation chez lanimal »Exemple : stratégie de neuroprotection »Limites dans une stratégie de remplacement? Utilisation en clinique exclue Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction Quantité de vecteur utilisée sous optimale Défaut de retrotranscription dun génome vecteur long Co-expression du transactivateur et du transgène Un vecteur versus deux vecteurs?

20 2. Développement dun seul vecteur lentiviral permettant lexpression régulée de shARN

21 LARN interférence

22 Expression des siARN

23 Pol III +1 Un promoteur dARN Polymérase III Le promoteur U6 Lexpression des shARN nécessite lutilisation dun promoteur dARN polymérase III - Débute la transcription à un nucléotide défini (G) - Arrêt de la transcription par 5 thymidines Site de démarrage de la transcription ESDESP TATA G TTTTT core SNAPc TBP STAF1Oct1 shARN

24 Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN Stratégie négative : encombrement stérique inductible dun promoteur polymérase III Protéine ESDESP shARN TATA SNAPc TBP Pol III Avec inducteur : synthèse des siARN inducteur Pol III ESDESP shARN TATA SNAPc TBP

25 Pol III Avec Doxycycline : synthèse des siARN doxycycline Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline répresseur Tet ESDESP shARN TATA Tet0 SNAPc ESDESP shARN TATA TetO SNAPc TBP Pol III

26 Un promoteur U6 régulable : Stratégie négative ESDESP TetO TATATetOESDESP TetO TATA ESDESP TetO TATAESDESP TetO TATATetO ESD TATA ESP ESDESP TetO TATATetOESDESP TetO TATATetO

27 Inhibition de l expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP % de cellules GFP positives

28 Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur dARN polymérase III Utilisation dun transactivateur de lARN polymerase III Utilisation dun promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline

29 Développement dun transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la doxycycline Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2 rtTA Domaine de liaison à lADN du rtTA2-M2 VP16 Domaine transactivateur VP16 du virus HSV Domaine transactivateur Q18III(Q A)

30 Un nouveau promoteur ESPBoîte TATA Développement dun promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline DSE 7 TetO

31 Pol III Un promoteur dARN Polymérase III inductible par la doxycycline ESPBoîte TATA 7 TetO +1 SNAPc TBP sens boucle antisens TTTTT 19 pb 9 pb antisens sens 5 UU shARN Oct-2 rtTA Dox

32 Un vecteur lentiviral pour lexpression régulée de shARN dirigé contre la GFP 5LTR 3LTR cPPT U3 PPT Ψ P PGK rtTA-Oct2WPRE P U6 min shGFP - dox + dox Pas dexpression de shGFPSynthèse de la GFP Expression de shGFPInhibition de la GFP

33 Une expression de shGFP régulée + Dox - Dox Northern Blot Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP

34 Expression de shGFP en fonction de la concentration de doxycycline - Dox+ Dox

35 Cinétique dexpression du shARN - Dox + Dox - Dox

36 Application du système pour la régulation dun gène endogène : p53 HEK293T A549 MCF-7

37 Résumé Construction dun système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN Validation du contrôle dun gène endogène Forte inductibilité Système réversible Forte concentration de doxycycline

38 Limites et perspectives Dose de doxycycline Validation in vivo Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II

39 Conclusion générale Construction dun seul vecteur lentiviral pour lexpression régulée par le système Tet-on dune protéine thérapeutique. Développement dun système de régulation de lexpression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation. Problème de limmunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique

40 Perspectives pour une utilisation clinique Se tourner vers un système de régulation dorigine humaine ou « humanisé » pour la clinique –Rapamycine –ZFP synthétique Régulation Physiologique La régulation en cas de complication –Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites


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