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L'analyse quantitative en chromatographie : La méthode du standard interne.

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1 L'analyse quantitative en chromatographie : La méthode du standard interne.

2 Nature du produit Surface : proportionnelle à la quantité injectée.

3 Surface d'un pic gaussien S = 1,064 x h x w 1/2 = 0,625 x h x w b

4 Réponse du détecteur A chaque instant, le signal est proportionnel à la concentration en constituant présent dans la cellule de détection. La surface du pic entier est proportionnelle à la quantité totale passée dans le détecteur Sauf si le détecteur est saturé (concentration trop élevée). La réponse n'est plus linéaire.

5 Réponse du détecteur La réponse est variable d'un constituant à l'autre : les différences peuvent être très importantes dans certains types de détection. S A = k A. m A S B = k B. m B S C = k C. m C etc … S : surface; m : masse; k : facteur de réponse La valeur absolue des surfaces (et donc la valeur de k) dépend du réglage de la sensibilité du détecteur !

6 Premier cas : Volume injecté contrôlable et reproductible Soit un injecteur étanche d'HPLC, constitué d'une boucle d'injection d'un volume précis de 20 µL. On y introduit une solution standard de A, à 50 µg/mL. La quantité de A injectée vaut : 50 µg/mL x 0,020 mL = 1,0 µg

7 Premier cas : Volume injecté contrôlable et reproductible L'injection de solutions de concentrations croissantes, pour une même sensibilité du détecteur, permet d'établir une droite d'étalonnage :

8 Premier cas : Volume injecté contrôlable et reproductible Un échantillon contenant A est injecté. La surface du pic authentifié comme celui de A, est reportée sur la droite, ce qui fournit la concentration recherchée.

9 Deuxième cas : Volume injecté incontrôlable et non reproductible C'est le cas de toutes les injections GC. Causes : pertes variables dans l'injecteur (surtout en mode split) et celles-ci peuvent être discriminatoires. manque de précision des faibles volumes injectés. Illustration par les chiffres :

10 Volume injecté incontrôlable et non reproductible : Dosage par le standard interne. Hypothèse de base : les pertes tout au long de l’analyse, y compris dans l’injection, ne changent pas les proportions relatives des constituants du mélange. On ajoute dès lors un standard interne le plus tôt possible depuis le début de l’analyse. Critères de choix du standard interne : Il doit être absent dans l’échantillon à doser Il doit être convenablement séparé des pics voisins Son temps de rétention doit être proche du constituant à doser Son comportement devrait être identique à celui l’analyte dans toutes les étapes de traitement …

11 Volume injecté incontrôlable et non reproductible : Dosage par le standard interne. « Le comportement du SI devrait être identique à celui l’analyte dans toutes les étapes du traitement » Standard interne idéal ! Mais comment trouver une telle molécule ? Est-ce possible ? La détection par spectrométrie de masse permet de séparer des molécules chimiquement identiques mais différant par leur substitution isotopique : même comportement physico-chimique dans les opérations effectuées y compris même temps de rétention détection séparée de leurs pics chromatographiques grâce à la séparation dans l’analyseur de masse.

12 Volume injecté incontrôlable et non reproductible : Dosage par le standard interne. Première étape : étalonnage Préparation de solutions de concentrations connues contenant un rapport croissant de A (substance à doser) sur le standard interne (SI). Injections. Porter le rapport de surface en fonction du rapport de concentration.

13 Volume injecté incontrôlable et non reproductible : Dosage par le standard interne. Première étape : étalonnage L’équation de cette droite s’écrit : f : facteur de réponse de A par rapport au SI

14 Volume injecté incontrôlable et non reproductible : Dosage par le standard interne. Deuxième étape : l’ analyse L’échantillon est dopé en SI (concentration connue). Le chromatogramme fournit S A et S SI. Grâce à l’étalonnage, on obtient C A /C SI. Comme C SI est connu, on en déduit C A La précision de cette méthode atteint 0.5 à 1 %


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