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1 Les méthodes séparatives: la chromatographie I - Introduction II- Chromatographie sur colonne : aspects généraux III- La chromatographie liquide haute.

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1 1 Les méthodes séparatives: la chromatographie I - Introduction II- Chromatographie sur colonne : aspects généraux III- La chromatographie liquide haute performance (HPLC) III- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) IV- La chromatographie dexclusion stérique (SEC) V- Analyse quantitative

2 2 I- Introduction 1- Historique En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT ( ) purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec khrôma, couleur et graphein, écrire) quil définit comme lenregistrement graphique des couleurs. On assiste alors à la naissance de la chromatographie. En 1952, les biochimistes A. J. P Martin et R. L. M. Synge reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur contribution au développement de la chromatographie moderne. La chromatographie à connu un essor important durant ces 50 dernières années dont lorigine tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés une méthode séparative rapide et performante couplée à des détecteurs sensibles et variés. Aujourdhui chromatographie préparative chromatographie analytique

3 3 2- Définition : IUAPC (International Union of Pure and Applied Chemistry) La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation dun mélange homogène liquide ou gazeux. Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile qui se déplace. La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange. La phase stationnaire est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane. La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant lanalyte avec elle. L'élution est un processus au cours duquel les analytes sont entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement dune phase mobile.

4 3- Classification Selon la technologie mise en œuvre –Chromatographie sur colonne –Chromatographie de surface :sur papier ou sur couche mince (CCM) Selon la nature des phases –Selon la nature de la phase mobile on distingue: la chromatographie en phase liquide CPL la chromatographie en phase gazeuse CPG la chromatographie en phase supercritique CPS –Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: la chromatographie gaz / solide CGS la chromatographie gaz / liquide CGL la chromatographie liquide / solide CLS la chromatographie liquide / liquide CLL Selon la nature des phases phénomènes mis en jeu dans la séparation La chromatographie dadsorption basée sur les processus répétés dadsorption/désorption par la phase stationnaire (solide) La chromatographie de partage basée sur les différences de solubilité des molécules entre la phase stationnaire (liquide) et la phase mobile La chromatographie déchange dions Échange entre une phase stationnaire ionisée et un soluté ionisé ou ionisable La chromatographie dexclusion basée sur la séparation des molécules en fonction de leur taille La chromatographie daffinité Il sagit là dune association entre une molécule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites stériquement définis et de capacité déchange multiple 4

5 5 4- Les interactions Le partage des analytes est donc guidé par leurs interactions avec chacune des deux phases. Plus l'analyte interagit avec la phase stationnaire, plus son élution sera longue. Forces de dispersions induit/induit 0,5 à 10 kJ.mol -1 Toutes les molécules Interactions dipôle/dipôle permanent/permanent permanent/induit Molécules polaires Alcools Ethers Amides Amines Nitriles Molécules possédant des e - Liaisons hydrogène8 à 40 kJ.mol -1 Molécules possédant des H labiles Interactions diélectriques 40 à 85 kJ.mol -1 Ions

6 6 II- Chromatographie sur colonne: aspects généraux –Le processus chromatographique –Le chromatogramme et les pics chromatographiques –Les grandeurs fondamentales de la chromatographie –La relation fondamentale

7 7 1- Le processus chromatographique –La phase mobile est continuellement introduite sur la colonne –Léchantillon est introduit sans arrêter le flux de phase mobile –Les solutés se répartissent entre les deux phases –Les composés sont élués en fonction de leur affinité vis-à-vis des phases –Les solutés sont détectés en sortie de colonne par le détecteur (K A 1)

8 8 2- Le chromatogramme et les pics chromatographiques Le résultat de lanalyse est le chromatogramme (ensemble de pics) Le pic chromatographique représente la distribution statistique des temps de transit du composé dans la colonne : cest une courbe de Gauss ( en chromatographie idéale ) –Moyenne : temps de rétention –Variance ² : liée à l étalement de l arrivée des molécules Le temps de rétention est une grandeur qualitative :il est identique pour des conditions identiques Laire ou la hauteur est une grandeur quantitative

9 W : largeur du pic à une ordonnée déterminée A la base A la mi-hauteur

10 Isothermes de distribution : A: situation idéale pic gaussien B : situation dans laquelle la phase stationnaire est saturée C : situation inverse dans laquelle le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire Facteur de traînée : F t = b/a A : F t = 1 ; B : F t > 1 ; C : F t < 1

11 11 3- Les grandeurs de rétention Temps de rétention Temps de rétention: Le temps de rétention t R : temps écoulé entre linstant de linjection et celui déterminé au maximum du pic Le temps mort t m (ou t 0 ) : temps de rétention dun composé non retenu par la colonne Le temps de rétention réduit t R: différence entre temps de rétention et temps mort Top d injection temps Pic de l airPic de solut é t R t m t R t R = t R - t m Débit Longueur Porosité Section Vitesse linéaire Expression du temps mort:

12 Volumes de rétention Volumes de rétention : o Le volume de rétention V R : volume de phase mobile nécessaire à lélution du composé : V R = t R x D o Le volume mort V m : volume de phase mobile nécessaire à lélution dun composé non retenu par la colonne = volume de phase mobile dans la colonne = volume interstitiel accessible = V M V M = V 0 = t m x D = t 0 x D o Le volume de rétention réduit : différence entre volume de rétention et volume mort V R = V R – V M oOn démontre que : V R = V M + K V S avec V S = volume de phase stationnaire Le temps de rétention dépend Du couple soluté-phase stationnaire en CPG Du triplet soluté-phase stationnaire-phase mobile en CL Du débit de la phase mobile De la masse de phase stationnaire dans la colonne De la température de la colonne De la longueur de la colonne Le temps de rétention ne dépend pas De la quantité de soluté injecté De la nature et de l abondance des autres constituants De la nature de la phase mobile en CPG

13 13 4- Les grandeurs de rétention relatives Facteur de rétention ou facteur de capacité k Il décrit la vitesse de progression dun soluté dans la colonne –une valeur de k élevée indique que le composé est fortement retenu par la colonne et quil passe un temps significatif à interagir avec la phase stationnaire –Les chromatographistes essaient davoir des valeurs de k comprises entre 1 et 10 [soluté dans phase stationnaire] [soluté dans phase mobile] Volume de phase stationnaire Volume de phase mobile k est indépendant De faibles variations de débit Des dimensions de la colonne

14 Exercice dapplication : Exprimer le temps danalyse, assimilable au temps de rétention du composé le plus retenu en fonction de la longueur de colonne L, de la vitesse de la phase mobile u et des volumes de phase mobile V M et de phase stationnaire V S dans la colonne avec donc

15 15 5- Lefficacité : Nombre détages théoriques N Le nombre détages théoriques mesure la dispersion de lanalyse lors de sa traversée de la colonne Les équilibres sur la colonne - Analogie avec une colonne à distillée 5 Plateaux 5 équilibres 64 mg de A K=1

16 N dépend De la nature de la colonne (capillaire ou remplie) De la qualité de la préparation de cette colonne De la façon dont elle est employée La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) L = longueur de la colonne

17 La théorie des plateaux néglige le passage continue de la phase mobile sur la phase stationnaire Ce passage produit un élargissement ou un rétrécissement des pics Giddings lie la HEPT à des paramètres qui dépendent de la vitesse de la phase mobile Equation de Van Deemter A = diffusion turbulente due à lécoulement irrégulier de la phase mobile à travers la phase stationnaire (particules plus ou moins régulières) indépendant du débit ne dépend que des particules ( quand le diamètre ) B = diffusion longitudinale, rend compte de la diffusion des molécules dans la direction de lécoulement dautant plus important que la vitesse est faible C = transfert de masse représente les inégalités de passage des molécules dune phase à lautre Toutes les molécules ne sont pas entraînées à la même vitesse Le contact entre phase mobile et phase stationnaire ne seffectue pas partout de manière identique Le molécules de solutés dans la phase stationnaire sont situées à des distance variables de la phase mobile Dm coefficient de diffusion dans la phase mobile ; tortuosité u = vitesse de la phase mobile, dépend de : La température La pression La colonne

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19 19 6- Le facteur de sélectivité : Décrit la position de 2 pics adjacents situés sur un chromatogramme. Il est toujours supérieur à 1. représente la capacité quà une colonne à séparer chimiquement deux composés > 1 Équilibre C S C M

20 20 7- Le facteur de résolution Rs Donne la mesure quantitative de laptitude dune colonne à séparer deux solutés :largeur du pic à la base

21 Exercice dapplication : Exprimer Rs en fonction des largeurs des pics à mi-hauteur

22 22 8- Relation fondamentale Terme cinétiqueTerme thermodynamique Relation de PURNELL Relation dapproximation

23 Exercice dapplication : A ) Montrer que lexpression de Purnell est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des largeurs égales ( 1 = 2 )

24 B ) Montrer que la relation dapproximation est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des efficacités égales (N 1 = N 2 )

25 On multiplie par ( ) le numérateur et le dénominateur


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