La Mort Cellulaire en Radiothérapie

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1 La Mort Cellulaire en Radiothérapie
C. HENNEQUIN, Hôpital Saint-Louis, Paris S. RIVERA Gustave Roussy, Villejuif

2 Mort cellulaire: Définition
Mort cellulaire ou mort clonogénique: perte de la capacité proliférative Effet recherché en radiothérapie Tests clonogéniques

3 Mort cellulaire 1/ Cellules proliférantes
 perte de la capacité de prolifération Intérêt dans le traitement du cancer Disparition des cellules clonogéniques 2/ Cellules différenciées Cellules nerveuses, musculaires, secrétoires, …  Perte de la fonction Tissus sains +++ Toxicité

4 Cell response to ionizing radiation
IR • Hypoxia • Free radical scavengers • Chromatin structure DNA double strand break induction • Cell cycle arrest to allow repair • Repair enzymes - production in response to damage - rate and accuracy of repair DNA double strand break repair Tolerance of residual damage Cell lives Cell death Cell dies

5 Effets cellulaires des radiations ionisantes
Formation de lésions sur l’ADN Activation de voies de signalisation => Expression génique modifiée => Synthèse/dégradation protéique Mutations/ aberrations chromosomiques Altération de la progression du cycle cellulaire Modifications du phénotype Mort cellulaire

6 Types de lésions crées Lésions létales:
Ne peuvent pas être réparées Entraînent la mort cellulaire rapide Lésions potentiellement létales (PLD) Peuvent être réparées si les caractéristiques Du milieu s’y prêtent Lésions sublétales (SLD): Peuvent être réparées si on leur laisse le temps

7 Concept de SLD Lésion sub létale
Lésion potentiellement réparables si on laisse le temps aux réparations d’avoir lieu 1 2 3 4 5 Fraction Survivante Temps de réparation Variable d’un tissu à l’autre Heures Délai entre deux fractions

8 Evènements conduisant à la Mort cellulaire radio-induite
RI Réparation ad integrum Défauts de réparation Réparation Temps Phase cycle Chromosomes Apoptose Oncose (nécrose) Mort différée Instabilité génomique Translocations Inversions Capture télomères Délétions Acentriques Dicentriques Cassures p53 P Sénescence p21Waf1 Autres???

9 Les différents types de mort cellulaire
Mort immédiate Senescence Mort mitotique Oncose (nécrose) Mort différée Apoptose Non programmée Programmée Cellules épithéliales Fibroblastes Cell. Épithéliales Mutations/délétions pT53 Lymphocytes Thymocytes Prostate Acini salivaires Cryptes intestinales Cell. endothéliales + différentiation terminale

10 Mort immédiate Survient quelques minutes/heures après l’irradiation
Forte dose de rayonnement Hyperactivation de la PARP Perte de l’intégrité membranaire, activation des lysosomes, Dégradation rapide des organites intra-cellulaires PARP is found in the cell’s nucleus. The main role is to detect and signal single-strand DNA breaks (SSB) to the enzymatic machinery involved in the SSB repair. PARP activation is an immediate cellular response to metabolic, chemical, or radiation-induced DNA SSB damage. Once PARP detects a SSB, it binds to the DNA, and, after a structural change, begins the synthesis of a poly (ADP-ribose) chain (PAR) as a signal for the other DNA-repairing enzymes such as DNA ligase III (LigIII), DNA polymerase beta (polβ), and scaffolding proteins such as X-ray cross-complementing gene 1 (XRCC1). After repairing, the PAR chains are degraded via Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG).[1] It is interesting to note that NAD+ is required as substrate for generating ADP-ribose monomers. The overactivation of PARP may deplete the stores of cellular NAD+ and induce a progressive ATP depletion, since glucose oxidation is inhibited, and necrotic cell death. In this regard, PARP is inactivated by caspase-3 cleavage (in a specific domain of the enzyme) during programmed cell death. PARP enzymes are essential in a number of cellular functions,[2] including expression of inflammatory genes:[3] PARP1 is required for the induction of ICAM-1 gene expression by smooth muscle cells, in response to TNF.[4] +++ pour BER dna sle cadre de SSB

11 Sénescence/ Quiescence ou arrêt en G1
Arrêt en G1 irréversible : fibroblastes Disparition complète des cyclines et perte irréversible du pouvoir de prolifération « Dose unique de 40 à 60 Gy » Fibroblastes métaboliquement actifs pdt de longues durées, (utilisés en cocultures comme supports) Observée initialement avec les fibroblastes sénescence réplicative Mais eput également être observée en cas d’activation abberante des mécanismes de réplication, par exemple en cas d’expression d’oncogénes activés. Au contraire de la quiescence, la sénescence ne peut être reversée en modifiant l’environnement cellulaire ou en apportant des nutriments in vitro Ce n’est pas non plus le point final d’une différentiation cellulaire. Actuellement observée en cas de persistance de foci de gh2AX Fibroblastes en culture Les cell. Jeunes sont petites et fixent peu la b-Galactosidase. Les cell. agées sont grandes, Multinuclées et positives pour la b-galactosidase

12 Sénescence Perte définitive de la capacité de prolifération tumorale
Mise en évidence par: secrétion accrue de b-galactosidase foci d’hétéro-chromatine spécifique Impliquée dans les effets de la RT sur les cellules prostatiques Voie métabolique: DNA damage ----> p > p > Arrêt du cycle cellulaire Rôle de p53 et de RB : les cellules p53 mutées ne peuvent pas entrer en sénescence Pas de sénescence chez les P53 mutées!

13 Autophagie Processus de digestion cellulaire
Dégradation lysosomale des protéines et organites Création d’un autophagosome au sein de la cellule contenant protéines/organites puis fusionnant avec les lysosomes Régulé génétiquement autophagy-related genes

14 Mécanismes de mort des cellules cancéreuses
Mort cellulaire autophagique Mort cellulaire de type 2

15 La mort cellulaire par autophagie

16 Mort cellulaire Mécanismes principaux:
Mort mitotique et Nécrose (Oncose) Apoptose Necrose et mort mitotique Survienent quand des lésions non réparées débouchent sur des aberrations chromosomiques (dicentriques, acentriques, …) Aux mitoses suivantes, ces aberrations conduisent À des « catastrophes mitotiques »

17 Mécanismes de mort des cellules cancéreuses
Mort cellulaire autophagique Mort cellulaire de type 2 Nécrose Mort cellulaire de type 3

18 La mort cellulaire par catastrophe mitotique
Divisions cellulaires asymétriques

19 Mort mitotique • Aberrations chromosomiques graves:
- Non transmises à la descendance - Conduisent à la mort cellulaire rapide • Aberrations « bénignes » (translocations, inversions, courtes délétions) Compatibles avec une survie clonogénique Mais instabilité génomique/chromosomique Responsables d’une mort cellulaire future Faible potentiel clonogénique => microcolonies

20 Mort mitotique différée
Après irradiation, Les cellules finissent par mourir mais après un nombre variable de divisions (jusqu’à 20) (Thompson, IJRB, 1969)

21 Mort mitotique différée
• Secondaire à des aberrations chromosomiques transmises Réarrangements complexes/dicentriques: Diminution de 30% et 50% à chaque mitose • Ou acquises après quelques divisions (Instabilité génomique) Augmentation de la fréquence des mutations de novo, des aberrations chromosomiques, et de la létalité Diminution de la capacité proliférative (Plating efficiency) des cellules irradiées De 15 à 20% par passage (Little, IJRB, 1990; Motherhill, IJRB, 1997; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)

22 Mort mitotique Incapacité à accomplir avec succés une mitose,
Conséquence de l’accumulation de lésions chromosomiques non réparées Apparition de cellules binuclées et géantes, et de micronoyaux Mort cellulaire prépondérante ds les cell. Épithéliales Peut déboucher sur nécrose (oncose) ou apoptose

23 Nécrose (Oncose) Reproductive cell death
Caractérisée par sa spécificité pour les cell. proliférantes Augmentation de la perméabilité membranaire Diminution rapide des synthèses protéiques gonflement des mitochondries, puis de la cellule Corrélation entre oncose et: quantité de lésions crées sur l’ADN aberrations chromosomiques (Ward, IJRB, 1990) Incapacité pour la cell. à réparer complétement et correctement les lésions de l’ADN Anomalies biochimiques/métaboliques Se traduit par un épaulement de la courbe de survie (lésions toxiques potentiellement réparables)

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25 NECROSE • Gonflement du cytoplasme et des organites
• Accroissement de la perméabilité membranaire (entrée des colorants: éosinophilie) • Condensation puis lyse chromatinienne sans oligomères de nucléosomes • Perte des organites cellulaires et vacuolisation • Infiltration par des cell. inflammatoires Kerr, 1965: Observations morphologiques

26 La mort cellulaire par nécrose

27 Nécrose cellulaire V79 irradiés à la dose de 5 Gy après 7 jours
A: colonie normale B,C: colonies irradiées

28 SQ20B cells, a radio-resistant human head and neck carcinoma model.

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30 Apoptose Décrit initialement comme une mort en Interphase
(ne nécessitant pas de mitoses) Décrite chez les lymphocytes, les cell. Seminomateuses et les ovocytes Processus actif, necessitant la synthèse de nbres protéines Mort programmée

31 Evenements déclenchant l'apoptose
- selon les types cellulaires • Différenciation cellulaire lors du dévellopement • Suppression hormonale ou de facteurs de croissance • Signal de mort (récepteur FasAPO-1/CD95 des lymphocytes) • TGF-ß, TNF, corticoïdes, … • Perte d’adhésion (anoikis) • DNA-damaging agents: Drogues, toxines, Rayons X, …

32 Apoptotic signals Initiator caspases Coactivators Inhibitors
Apoptosis Apoptotic signals Initiator caspases Coactivators Inhibitors Effector caspases

33 Biochimie de l'apoptose: Activation des Endonucléases
• Endonucléases: coupent l'ADN entre les nucléosomes => fragments mutiples de 185 bp => "Apoptotic ladder" sur gel d'agarose • Reconnaissance topologique et non d'une séquence d'ADN • Activation: - endonucléases DNAse I et II - NUC-18 (Thymocytes)

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35 Apoptose: vue générale
Voie extrinséque Voie intrinséque Signals TNF-related proteins - GF withdrawal - X-rays, Chemo Caspase activators Death effectors: FADD, TRADD Cytochrome C Release Initiator caspases Caspases 8, (10) Apaf-1 Caspase 9 Effector caspases Caspases 3, (6-7) APOPTOSE

36 Voie intrinséque Cytotoxic signals Bcl2 Bax CytochromeC Apaf-1
Apoptosome Relarguage du cytochrome C: critical checkpoint de l’apoptose Activation de Apaf-1 et la caspase 9 Apaf-1 et la caspase 9 se lient via un domaine CARD spécifique, mais aussi par d’autres intercations. Apaf-1: apoptosis protease activating factor 1 contient une région CARD, normalement masquée - fixation du cytochrome C sur apaf-1 => démasquage de CARD Apaf-1: homologue de CED-4 Caspase 9: homologue de CED-3 bcl2: homologue de CED 9 Caspase 9 IAPs Diablo Caspase 3 IAPs: Inhibiteurs de l’apoptose

37 La mort cellulaire par apoptose

38 Apoptose post -irradiation
L’importance de la composante apoptotique modifie la composante a de la courbe de survie Pas d’effet dose/apoptose; pas d’effet du débit de dose (Stephens, Rad Res, 1993; Meyn, IJRB, 1993; Clifton, Radioth. Oncol., 1994) L’induction d’apoptose ne s’estompe pas d’une séance à l’autre (Meyn, IJROBP, 1994) Alpha lié à la proba d’évènnement directement létal

39 Apoptose radio-induite
Survient classiquement dans les 48 hr suivant RT avant la mitose mort en interphase (Stephens, Rad Res, 1991) déclenchée par les DSB (Story, IJRB, 1994)

40 DNA damage Radiation sensors P53 activation Signal transduction Caspases Bax Fas P21; Rb Mdm2 Gadd45 Apoptosis Growth arrest

41 Apoptose p53 dépendante p53 indépendante - Privation hormonale
- Privation des facteurs de croissance - Corticoïdes (thymocytes) - Radiations X et UV - Chimiothérapie - Virus

42 Apoptose Radio-Induite
- Requiert la p53 (+++) (Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992) Thymocytes des souris p53 -/-: pas d’apoptose radio-induite (Clarke, Nature, 1993; Lowen, Blood, 1993; Lowe, Nature, 1993) Cell. Cryptiques intestinales: souris Nles: apoptose souris p53 -/-: pas d’apoptose (Clarke, Oncogene, 1994) L’irradiation accroît l’activité p53 cellulaire ( Zhan, Mol Cell Biol, 1993) Les cellules p53 mutées seraient donc plus radio-résistantes (Lowe, Science, 1994)

43 p53 status and the Efficacy of Cancer Therapy In Vivo
Lowe, Science, 1994 Fibrosarcoma cell lines p53 +/+ or p53 -/- Injected in nude mices Irradiation (7Gy oy 14 Gy) or Adriamycin treatment Death by apoptosis after irradiation or chemotherapy

44 p53 +/+ 7 Gy p53 -/- 14 Gy Adria Lowe, Science, 1994

45 Radiation-induced apoptosis
Bax (Noxa) Relarguage du cytochrome C des mitochondries Apaf-1/casp-9 Bcl2

46 Reproductive integrity
DNA damage outcomes ATM DNA-DSB DNA-PK (p450, Ku 70/86) p53 p21 Bax Bcl2 Apoptosis G2/S/G1 delay Repair Reproductive integrity

47 P53 au centre de la réponse aux dommages radio-induits

48 P53: gardien du génome Liaison aux Hélicases: Liaison aux protéines
Acteur direct de la réponse aux lésions de l’ADN Liaison aux Hélicases: WRN: Sdr de Werner BLM: Sdr de Bloom RECQ4: Sdr de Rothmund-Thomson Liaison aux protéines XPD, XPB et CSB (Hélicases) Du Nucléotide-excision repair (NER) (Wang, Nature Genet, 1995; Leveillard, EMBO J, 1996) Apoptose Radio ou Chimio Induite: Dans les lignées déficientes en Hélicases, l’apoptose est nettement diminuée; Les liaisosn p53/hélicases facilitent l’apoptose Facilite la « base excision repair » (Offer, FEBS Lett., 1999)

49 Action directe de la P53 sur la réparation des DSBs
Selon le statut p53 (Test de la comète en haut Et Foci H2AX en bas) Lignée HCT116 wP53 carrés noirs Ou déficiente en p53 carrés blancs Les cellules déficientes en p53 réparent moins bien les DSBS Mirzayans, IJROBP, 66: , 2006 Al Rashid, Cancer Res, 2005; 65: Mirzayans, IJROBP, 2006

50 Role de Bax dans l’apoptose radio-induite
Augmentation p53 dépendante de Bax après RT Démontrée dans plusieurs lignées cellulaires Mais: Induction d’Apoptose par p53 observée sans augmentation de Bax Les souris Bax -/- ont une apoptose p53 dépendante post-RT nle

51 Quatre voies apoptotiques
P53 --> BAX ---> Voie intrinsèque DNA damage ---> Ceramide synthase ---> Voie intrinséque Atteinte membranaire ---> activation de la sphingomyélinase ---> transformation de la sphingomyéline en céramide ---> activation de la voie intrinséque Activation de la voie extrinséque

52 Target for Radiation-induced Apoptosis: The plasma membrane ?
Activation directe de la sphingomyelinase membranaire RT Ceramide Sphingomyelin Voie métabolique Du stress (Santana, Cell, 1996 Chumura, Cancer Res, 1997) Apoptose

53 Quatre voies apoptotiques
Sphingomyelinase Ceramide Ceramide synthase DNA damage p53 Bax Apoptose Fas Caspase 8 Death Receptor

54 Apoptose et Réponse à l’irradiation
Importance du phénoméne apoptotique après irradiation ? Dépend des tissus étudiés Très variable d’une tumeur à l’autre par ex., les fibroblastes ne meurent pas d’apoptose (Yanagihara, IJRB, 1995) alors que c’est le principal mode de mort des cell hématopoïétiques L’induction d’apoptose semble corrélée au contrôle tumoral Dans certaines lignées, pas de corrélation entre apoptose radio-induite et survie cellulaire (Alridge, Br J Cancer, 1995)

55 Comparison of apoptotic response in 15 different tumours

56 Apoptose et irradiation fractionnée
Chen, Rad Res, Rat embryo cells A 2 Gy: - Survie avec apoptose: - Survie sans apoptose: Apres 32 fractions - Survie avec apoptose: - Survie sans apoptose: => Prob. de contrôle local diminuée de 30%

57 Apoptose spontanée dans les tumeurs
Rare Dans le cancer du col utérin: Entre 0 et 4% des cellules (Levine, Lancet, 1994, 344: 472) Facteur pronostique avant radiothérapie ? => Données contradictoires

58 Nouvelles hypothéses La cible: l ’ADN La cible: membrane/cytoplasme
Effet bystander: induction de phénomènes biologiques dans des cellules qui ne sont pas traversées par des particules – mais proches des cellules irradiées Mis en évidence par l’utilisation de minifaisceaux (particule alpha) capables d’irradier le noyau d’une cellule Induction de mort cellulaire dans les cellules proches de la cellule irradiée Secrétion par la cellule irradiée de molécules induisant la mort cellulaire Bystander effect

59 Entose ou cannibalisme cellulaire
Post-Doc2 Entose ou cannibalisme cellulaire Overholtzer et al. Cell Mort cellulaire non apoptotique Internalisation d’une cellule vivante dans une cellule vivante Elimination de la cellule internalisée par les lysosomes de la cellule hôte

60 Cannibalisme cellulaire dans les tumeurs
Post-Doc2 Cannibalisme cellulaire dans les tumeurs Pleural effusion MUC-1 b-cat Breast tumor b-cat Cytokeratin 5 b-cat Melanoma Cano et al, EMBO Molecular Medicine (2012) Florey et al, Nature Cell Biology (2011) Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011) Guadamillas, Journal of Cell Science (2011) Yuan, et al, Genes and Development (2010) Wang et al, Cell Research (2009) Overholtzer et al, Cell (2007) White et al, Cell (2007)

61 Conclusion: mort cellulaire en radiobiologie
= Perte de la capacité de division et non disparition physique de la cellule!!! Une cellule morte peut métaboliser La létalité ↗ avec la dose mais la cinétique de réparation est constante