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La Mort Cellulaire en Radiothérapie C. HENNEQUIN, Hôpital Saint-Louis, Paris S. RIVERA Gustave Roussy, Villejuif.

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1 La Mort Cellulaire en Radiothérapie C. HENNEQUIN, Hôpital Saint-Louis, Paris S. RIVERA Gustave Roussy, Villejuif

2 Mort cellulaire: Définition Mort cellulaire ou mort clonogénique: perte de la capacité proliférative Effet recherché en radiothérapie Tests clonogéniques

3 Mort cellulaire 1/ Cellules proliférantes  perte de la capacité de prolifération Intérêt dans le traitement du cancer Disparition des cellules clonogéniques 2/ Cellules différenciées Cellules nerveuses, musculaires, secrétoires, …  Perte de la fonction Tissus sains +++ Toxicité

4 Cell response to ionizing radiation IR DNA double strand break induction DNA double strand break repair Tolerance of residual damage Hypoxia Free radical scavengers Chromatin structure Cell cycle arrest to allow repair Repair enzymes - production in response to damage - rate and accuracy of repair Cell lives Cell dies Cell death

5 Effets cellulaires des radiations ionisantes -Formation de lésions sur l’ADN - Activation de voies de signalisation => Expression génique modifiée => Synthèse/dégradation protéique - Mutations/ aberrations chromosomiques - Altération de la progression du cycle cellulaire - Modifications du phénotype - Mort cellulaire

6 Types de lésions crées Lésions létales: Ne peuvent pas être réparées Entraînent la mort cellulaire rapide Lésions potentiellement létales (PLD) > Peuvent être réparées si les caractéristiques Du milieu s’y prêtent Lésions sublétales (SLD): > Peuvent être réparées si on leur laisse le temps

7 Concept de SLD Lésion sub létale Lésion potentiellement réparables si on laisse le temps aux réparations d’avoir lieu Fraction Survivante Heures Délai entre deux fractions Temps de réparation Variable d’un tissu à l’autre

8 RI Réparation ad integrum Défauts de réparation Réparation Temps Phase cycle Chromosomes Apoptose Oncose (nécrose) Mort différée Instabilité génomique Translocations Inversions Capture télomères Délétions Acentriques Dicentriques Cassures p53 P Sénescence p21 Waf1 Evènements conduisant à la Mort cellulaire radio-induite Autres???

9 Les différents types de mort cellulaire Mort immédiate SenescenceMort mitotique Oncose (nécrose) Mort différée Apoptose Non programmée ProgramméeNon programméeProgrammée Cellules épithéliales FibroblastesCell. Épithéliales Mutations/délétions pT53 Lymphocytes Thymocytes Prostate Acini salivaires Cryptes intestinales Cell. endothéliales

10 Mort immédiate Survient quelques minutes/heures après l’irradiation Forte dose de rayonnement Hyperactivation de la PARP Perte de l’intégrité membranaire, activation des lysosomes, Dégradation rapide des organites intra-cellulaires

11 Sénescence/ Quiescence ou arrêt en G1 Arrêt en G1 irréversible : fibroblastes Disparition complète des cyclines et perte irréversible du pouvoir de prolifération « Dose unique de 40 à 60 Gy » Fibroblastes métaboliquement actifs pdt de longues durées, (utilisés en cocultures comme supports) Fibroblastes en culture Les cell. Jeunes sont petites et fixent peu la  -Galactosidase. Les cell. agées sont grandes, Multinuclées et positives pour la  -galactosidase

12 Sénescence  Perte définitive de la capacité de prolifération tumorale  Mise en évidence par:  secrétion accrue de  -galactosidase  foci d’hétéro-chromatine spécifique  Impliquée dans les effets de la RT sur les cellules prostatiques Voie métabolique: DNA damage ----> p > p > Arrêt du cycle cellulaire Pas de sénescence chez les P53 mutées!

13 Autophagie Processus de digestion cellulaire Dégradation lysosomale des protéines et organites Création d’un autophagosome au sein de la cellule contenant protéines/organites puis fusionnant avec les lysosomes Régulé génétiquement autophagy-related genes

14 Mécanismes de mort des cellules cancéreuses Mort cellulaire autophagique Mort cellulaire de type 2

15 La mort cellulaire par autophagie

16 Mort cellulaire  Mécanismes principaux:  Mort mitotique et Nécrose (Oncose)  Apoptose  Necrose et mort mitotique  Survienent quand des lésions non réparées débouchent sur des aberrations chromosomiques (dicentriques, acentriques, …) Aux mitoses suivantes, ces aberrations conduisent À des « catastrophes mitotiques »

17 Mécanismes de mort des cellules cancéreuses Mort cellulaire autophagique Mort cellulaire de type 2 Nécrose Mort cellulaire de type 3

18 La mort cellulaire par catastrophe mitotique Divisions cellulaires asymétriques

19 Mort mitotique Aberrations chromosomiques graves: - Non transmises à la descendance - Conduisent à la mort cellulaire rapide Aberrations « bénignes » (translocations, inversions, courtes délétions) Compatibles avec une survie clonogénique Mais instabilité génomique/chromosomique Responsables d’une mort cellulaire future Faible potentiel clonogénique => microcolonies

20 Mort mitotique différée Après irradiation, Les cellules finissent par mourir mais après un nombre variable de divisions (jusqu’à 20) (Thompson, IJRB, 1969)

21 Mort mitotique différée Secondaire à des aberrations chromosomiques transmises Réarrangements complexes/dicentriques: Diminution de 30% et 50% à chaque mitose Ou acquises après quelques divisions (Instabilité génomique) Augmentation de la fréquence des mutations de novo, des aberrations chromosomiques, et de la létalité  Diminution de la capacité proliférative (Plating efficiency) des cellules irradiées De 15 à 20% par passage (Little, IJRB, 1990; Motherhill, IJRB, 1997; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)

22 Mort mitotique Incapacité à accomplir avec succés une mitose, Conséquence de l’accumulation de lésions chromosomiques non réparées Apparition de cellules binuclées et géantes, et de micronoyaux Mort cellulaire prépondérante ds les cell. Épithéliales Peut déboucher sur nécrose (oncose) ou apoptose

23 Nécrose (Oncose) Reproductive cell death -Caractérisée par sa spécificité pour les cell. proliférantes - Augmentation de la perméabilité membranaire - Diminution rapide des synthèses protéiques - gonflement des mitochondries, puis de la cellule -Corrélation entre oncose et: - quantité de lésions crées sur l’ADN - aberrations chromosomiques (Ward, IJRB, 1990) -Se traduit par un épaulement de la courbe de survie (lésions toxiques potentiellement réparables) Incapacité pour la cell. à réparer complétement et correctement les lésions de l’ADN Anomalies biochimiques/métaboliques

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25 NECROSE Kerr, 1965: Observations morphologiques Gonflement du cytoplasme et des organites Accroissement de la perméabilité membranaire (entrée des colorants: éosinophilie) Condensation puis lyse chromatinienne sans oligomères de nucléosomes Perte des organites cellulaires et vacuolisation Infiltration par des cell. inflammatoires

26 La mort cellulaire par nécrose

27 Nécrose cellulaire V79 irradiés à la dose de 5 Gy après 7 jours A: colonie normale B,C: colonies irradiées

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30 Apoptose Décrit initialement comme une mort en Interphase (ne nécessitant pas de mitoses) Décrite chez les lymphocytes, les cell. Seminomateuses et les ovocytes Processus actif, necessitant la synthèse de nbres protéines Mort programmée

31 Evenements déclenchant l'apoptose - selon les types cellulaires Différenciation cellulaire lors du dévellopement Suppression hormonale ou de facteurs de croissance Signal de mort (récepteur Fas APO-1/CD95 des lymphocytes) TGF-ß, TNF, corticoïdes, … Perte d’adhésion (anoikis) DNA-damaging agents: Drogues, toxines, Rayons X, …

32 Apoptosis Apoptotic signals Initiator caspases Effector caspases CoactivatorsInhibitors

33 Biochimie de l'apoptose: Activation des Endonucléases Endonucléases: coupent l'ADN entre les nucléosomes => fragments mutiples de 185 bp => "Apoptotic ladder" sur gel d'agarose Reconnaissance topologique et non d'une séquence d'ADN Activation: - endonucléases DNAse I et II - NUC-18 (Thymocytes)

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35 Apoptose: vue générale Voie extrinséqueVoie intrinséque SignalsTNF-related proteins - GF withdrawal - X-rays, Chemo Caspase activators Death effectors: FADD, TRADD Cytochrome C Release Initiator caspasesCaspases 8, (10) Apaf-1 Caspase 9 Effector caspases Caspases 3, (6-7) APOPTOSE

36 Voie intrinséque CytochromeC Bcl2Bax Cytotoxic signals Apaf-1 Caspase 9 Caspase 3 Apoptosome IAPsDiablo IAPs: Inhibiteurs de l’apoptose

37 La mort cellulaire par apoptose

38 Apoptose post -irradiation  L’importance de la composante apoptotique modifie la composante  de la courbe de survie  Pas d’effet dose/apoptose; pas d’effet du débit de dose (Stephens, Rad Res, 1993; Meyn, IJRB, 1993; Clifton, Radioth. Oncol., 1994)  L’induction d’apoptose ne s’estompe pas d’une séance à l’autre (Meyn, IJROBP, 1994)

39 Apoptose radio-induite  Survient classiquement dans les 48 hr suivant RT  avant la mitose  mort en interphase (Stephens, Rad Res, 1991)  déclenchée par les DSB (Story, IJRB, 1994)

40 DNA damage Radiation sensors P53 activation Signal transduction P21; Rb Mdm2 Gadd45 Growth arrest Caspases Bax Fas Apoptosis

41 Apoptose p53 dépendante - Radiations X et UV - Chimiothérapie - Virus p53 indépendante - Privation hormonale - Privation des facteurs de croissance - Corticoïdes (thymocytes)

42 Apoptose Radio-Induite - Requiert la p53 (+++) (Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992) - L’irradiation accroît l’activité p53 cellulaire ( Zhan, Mol Cell Biol, 1993) - Les cellules p53 mutées seraient donc plus radio-résistantes (Lowe, Science, 1994) Thymocytes des souris p53 -/-: pas d’apoptose radio-induite (Clarke, Nature, 1993; Lowen, Blood, 1993; Lowe, Nature, 1993) Cell. Cryptiques intestinales: souris Nles: apoptose souris p53 -/-: pas d’apoptose (Clarke, Oncogene, 1994)

43 p53 status and the Efficacy of Cancer Therapy In Vivo Lowe, Science, 1994 Fibrosarcoma cell lines p53 +/+ or p53 -/- Injected in nude mices Irradiation (7Gy oy 14 Gy) or Adriamycin treatment Death by apoptosis after irradiation or chemotherapy

44 7 Gy 14 Gy Adria Lowe, Science, 1994 p53 +/+ p53 -/-

45 Radiation-induced apoptosis p53 Bax (Noxa) Relarguage du cytochrome C des mitochondries Apaf-1/casp-9 Bcl2

46 DNA damage outcomes DNA-DSB ATM DNA-PK (p450, Ku 70/86) p53 Bax Bcl2 Apoptosis p21 G2/S/G1 delay Repair Reproductive integrity

47 P53 au centre de la réponse aux dommages radio-induits

48 P53: gardien du génome P53: Acteur direct de la réponse aux lésions de l’ADN Liaison aux protéines XPD, XPB et CSB (Hélicases) Du Nucléotide-excision repair (NER) (Wang, Nature Genet, 1995; Leveillard, EMBO J, 1996) Liaison aux Hélicases: WRN: Sdr de Werner BLM: Sdr de Bloom RECQ4: Sdr de Rothmund-Thomson Facilite la « base excision repair » (Offer, FEBS Lett., 1999)

49 Action directe de la P53 sur la réparation des DSBs Réparation des DSBs Selon le statut p53 (Test de la comète en haut Et Foci H2AX en bas) Lignée HCT116 wP53 carrés noirs Ou déficiente en p53 carrés blancs Mirzayans, IJROBP, 2006

50 Role de Bax dans l’apoptose radio-induite -Augmentation p53 dépendante de Bax après RT Démontrée dans plusieurs lignées cellulaires -Mais: - Induction d’Apoptose par p53 observée sans augmentation de Bax - Les souris Bax -/- ont une apoptose p53 dépendante post-RT nle

51 Quatre voies apoptotiques P53 --> BAX ---> Voie intrinsèque DNA damage ---> Ceramide synthase ---> Voie intrinséque Atteinte membranaire > ---> activation de la sphingomyélinase > ---> transformation de la sphingomyéline en céramide > ---> activation de la voie intrinséque Activation de la voie extrinséque

52 Target for Radiation-induced Apoptosis: The plasma membrane ? RT Activation directe de la sphingomyelinase membranaire CeramideSphingomyelin Apoptose Voie métabolique Du stress (Santana, Cell, 1996 Chumura, Cancer Res, 1997)

53 Quatre voies apoptotiques DNA damage Ceramide synthase Ceramide Sphingomyelinase p53Bax Fas Death Receptor Caspase 8 Apoptose

54 Apoptose et Réponse à l’irradiation  Importance du phénoméne apoptotique après irradiation ? Dépend des tissus étudiés Très variable d’une tumeur à l’autre par ex., les fibroblastes ne meurent pas d’apoptose (Yanagihara, IJRB, 1995) alors que c’est le principal mode de mort des cell hématopoïétiques  L’induction d’apoptose semble corrélée au contrôle tumoral  Dans certaines lignées, pas de corrélation entre apoptose radio-induite et survie cellulaire (Alridge, Br J Cancer, 1995)

55 Comparison of apoptotic response in 15 different tumours

56 Apoptose et irradiation fractionnée Chen, Rad Res, Rat embryo cells - Survie avec apoptose: Survie sans apoptose: 0.67 A 2 Gy: Apres 32 fractions - Survie avec apoptose: Survie sans apoptose: => Prob. de contrôle local diminuée de 30%

57 Apoptose spontanée dans les tumeurs - Rare - Dans le cancer du col utérin: Entre 0 et 4% des cellules (Levine, Lancet, 1994, 344: 472) -Facteur pronostique avant radiothérapie ? => Données contradictoires

58 Nouvelles hypothéses La cible: l ’ADN La cible: membrane/cytoplasme Bystander effect

59 Entose ou cannibalisme cellulaire Post-Doc2  Mort cellulaire non apoptotique  Internalisation d’une cellule vivante dans une cellule vivante  Elimination de la cellule internalisée par les lysosomes de la cellule hôte Overholtzer et al. Cell

60 Pleural effusion MUC-1 b-cat Breast tumor b-cat Cano et al, EMBO Molecular Medicine (2012) Florey et al, Nature Cell Biology (2011) Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011) Guadamillas, Journal of Cell Science (2011) Yuan, et al, Genes and Development (2010) Wang et al, Cell Research (2009) Overholtzer et al, Cell (2007) White et al, Cell (2007) Cannibalisme cellulaire dans les tumeurs Post-Doc2 Cytokeratin 5 b-cat Melanoma

61 Conclusion: mort cellulaire en radiobiologie = Perte de la capacité de division et non disparition physique de la cellule!!! Une cellule morte peut métaboliser La létalité ↗ avec la dose mais la cinétique de réparation est constante


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