Bienvenue à la Première Journée Lyonnaise de PCR Vétérinaire

Présentation au sujet: "Bienvenue à la Première Journée Lyonnaise de PCR Vétérinaire"— Transcription de la présentation:

1 Bienvenue à la Première Journée Lyonnaise de PCR Vétérinaire
LSI – LABORATOIRE SERVICE INTERNATIONAL LE BOIS DIEU – LISSIEU – FRANCE TEL: 33 (0) – FAX: 33 (0)

2 Programme 10h h15 : Principes généraux de l’extraction et de la purification des acides nucléiques à partir des prélèvements animaux (sang, sérum, organes, lait …) Arnaud BRUYERE – Qiagen 11h h00 : Principes de la PCR temps réel - Présentation de l’Abiprism 7000 David FAVY - Applied Biosystems 12h h45 : Les Kits PCR pour la détection du BVDV, de M.paratuberculosis et du virus de la SDRP – Informations sur M. bovis, Avian pneumovirus et Fièvre Q Eric SELLAL, Cécile DIVES, Evelyne CREUSOT, Candice ALIX - LSI 12h h00 : Discussion 13h h00 : Repas 14h h00 : Applications de la PCR Quantitative au diagnostic et au contrôle de la BVD Alain JOLY - GDS 56 - VANNES 15h h00 : Applications de la PCR Quantitative au diagnostic et au contrôle de M.paratuberculosis Alain DOUART - Ecole Nationale vétérinaire - NANTES 16h h00 : Applications de la PCR Quantitative au monitoring porcin José CASAS - Laboratoire OVIS - Barcelone

3 Kits PCR Kits TAQVET - T. Kits
Applications à la détection des Pestivirus, du virus SDRP et de M. paratuberculosis Dr Eric SELLAL Cécile DIVES Evelyne CREUSOT Candice ALIX LSI – LABORATOIRE SERVICE INTERNATIONAL LE BOIS DIEU – LISSIEU – FRANCE TEL: 33 (0) – FAX: 33 (0)

4 Kits TAQVET - T. Kits Licences PCR
LSI a acquis 4 licences d’exploitation de brevets PCR auprès de Hoffman La Roche : Fabrication et commercialisation de Kits pour PCR Conventionnelle Fabrication et commercialisation de Kits pour PCR Temps réel y compris TaqMan® et FRET Service d’analyses PCR Conventionnelle Service d’analyses PCR Temps réel y compris Taqman et FRET En l’absence de ces licences, Hoffman La Roche est en droit d’exiger des royalties sur toute analyse facturée c’est-à-dire réalisée en dehors d’un objectif de recherche

5 Kits TAQVET 1/ Kits pour PCR en Temps réel 2/ Contiennent tous les réactifs pour les essais y compris EPC et IPC EPC : Contrôle Positif Externe : Contrôle positif à extraire IPC : Contrôle Positif Interne : Séquence connue ajoutée à l’échantillon avant l’extraction 3/ Les Kits TAQVET sont: - validés sur ABIPRISM 7000, 7900, Biorad i-Cycler, Opticon MJR - utilisables (avec adaptation) sur LightCycler I - en cours de validation sur LightCycler 2

6 T. Kits - validés sur Thermocycleurs ABI, Thermo Labsystems, MJ
1/ Kits pour PCR Conventionnelle 2/ Contiennent tous les réactifs pour les essais y compris EPC et IPC EPC: Contrôle Positif Externe : Contrôle positif à extraire IPC: Contrôle Positif Interne : Séquence connue ajoutée à l’échantillon avant l’extraction 3/ Les T. Kits sont : - validés sur Thermocycleurs ABI, Thermo Labsystems, MJ Research.

7 Les Applications des Kits TAQVET et T. Kits

8 I/ BVDV et Pestivirus 1/ Rappels sur les Pestivirus - Les Génotypes
- Les Veaux CI 2/ Pourquoi utiliser la PCR pour le diagnostic des Pestiviroses animales? 3/ Les Kits PCR et PCR Temps réel 4/ Conclusions

9 Rappels sur les Pestivirus
Famille: Flaviridae Genre: Pestivirus Génotypes (4): BVDV1 : Bovins, Ovins , Porcins BVDV2 : Bovins, Ovins, Porcins BD : Ovins, Bovins, Porcins PPC : Porcins (Bovins - Ovins????)

10 Question : IPI or not IPI ?
Calves of the same age. From Lee et al. CVJ 38:29

11 Les Protéines virales des Pestivirus
1/ Protéines structurales : Variabilité importante 3 glycoprotéines : Erns - E0 ou gp44/gp48 : Ag détecté par les Kits ELISA «Sérum » E2 : gp53 : Responsable de l’immunité humorale (Ac séroneutralisants) 2/ Protéines non structurales : Variabilité limitée p7, NS4A, NS4B, NS54, NS5B NS2/3 ou p80: Ag détecté par les Kits ELISA « Sang ou Leucocytes ». Virus à ARN

12 Le Génome (ARN Viral) 12,3 à 12,5 Kb de long Commence et termine par 2 séquences non transcrite: 5’UTR et 3’UTR Structurale Non-structurale 5’UTR N Pro C Erns E1 E2 NS23 NS4A NS4B NS5A-B 3’UTR 5’UTR : 5’ untranslated region: region non transcrite : région la plus constante au sein des pestivirus Structurale : Région hyper variable codant pour les glycoprotéines: gP44 (Erns), gP53 (E2),… Non Structurale : Région +/- constante au sein des virus BVDV mais variable au sein des pestivirus, codant pour la p80 (NS2/3),…

13 Exemple : Séquence de 60 pb / 5’UTR NADL (BVD1a) sert de référence
Génotypage Variabilité de la région 5’UTR des Pestivirus Exemple : Séquence de 60 pb / 5’UTR NADL (BVD1a) sert de référence Difficulté de dessiner des amorces capables de détecter tous les pestivirus

14 Les Génotypes du BVDV BVDV1 et BVDV2
Variabilité des séquences de nucléotides de l’ARN Viral Bien connu au niveau de la région 5’-UTR Il existe 2 génotypes principaux: BVDV1 et BVDV2 + 10 sous-génotypes (Groupes génétiques) au sein du génotype BVD1: BVDV 1 a, b, c, d , e, f, g, h, i, j (Vilcek, 2001)

15 Intérêt du génotypage Distribution des génotypes BVDV1/BVD2
Pays N° Virus 1-a 1-b 1 non a / non b II Belgique (Couvreur 2002) 27 1 15 4 7 (Dont 2 SVF et 1 Vaccin) Allemagne (Tajima 2001) 59 29 2 Espagne (Huratdo 2003) 41 35 (Plusieurs cas hémorragiques) 6 (1- e frontière française) Distribution des génotypes de pestivirus chez les ovins Pays N° Virus BD A BD B BD C (Nouveau) PPC Espagne (Hurtado 2003) 10 9 1 (Premier cas décrit)

16 Intérêt du génotypage (Exemple)
Distribution des sous–génotypes de BVDV1 dans différents pays (Vilcek, 2001) Pays N° Virus a b c d e f g h i j Canada 10 5 USA 17 7 UK 20 1 2 Nouvelle Zélande 6 Autriche 23 Suède France 3 13 Mozambique 8

17 Génotypage: Variabilité de la région 5’UTR des Pestivirus
Exemple: Dessin d’un F-primer capable de détecter les génotypes de «tous» les pestivirus «Genbank»

18 Génotypage et PCR Kit TAQVET BVDV Genotyping (Bicupule)
Detection différentielle des génotypes BVDV de type 1 et 2 BVDV + PPC + BDV Attention: Certains génotypes 1 sont susceptibles de fournir des résultats positifs en BVD1 et BVD2 «Exemple: Souche 1470 LSI » Kit TAQVET BVDV Screening Version 1 (Monocupule) T. Kits BVDV Détection simultanée des génotypes BVD de type 1 et 2 Kit TAQVET BVDV Screening Version 2 (Monocupule) Detection simultanée des génotypes BVD de type 1 et 2 BVDV + BDV Kit TAQVET PPC (Monocupule) Detection spécifique des génotypes PPC PPC

19 Les Veaux CI Infection après 160 jours de gestation:
Veaux normaux, séropositifs avant buvée colostrale Certains des ces veaux sont : non IPI mais présentent une virémie transitoire longue (1 à 6 mois), très sensibles aux infections néonatales peu ou pas détectés en ELISA Ag Veaux CI (Congenital infection – Claudia Monoz-Zanzi – Davis, USA, 2003)

20 Pourquoi utiliser la PCR pour Pestiviroses animales ?
le diagnostic des Pestiviroses animales ?

21 En raison des limites des techniques actuelles (ELISA)
1/ Mauvaise détection des veaux IPI sous Immunité colostrale 2/ Faible détection des VT (Virémiques transitoires ) et non distinction IPI/VT 3/ Absence d’utilisation sur mélanges 4/ Spécificité moyenne sur sang total et Sérum 5/ Réactions croisées entre les Pestivirus

22 Apports des Techniques PCR
1/ Détecter les IPI à tous les âges y compris les veaux sous immunité maternelle 2/ Détecter les VT (Virémiques transitoires ) et les distinguer des IPI 3/ Avoir un Coût abordable ( Travail sur Mélanges ) 4/ Sensible (Eviter les faux négatifs) 5/ Spécifique (Eviter les faux positifs) 6/ Détection spécifique de certains Pestivitus (PPC)

23 Les Veaux IPI difficilement
qui représentent la majorité des IPI en élevage sont difficilement détectables par les méthodes traditionnelles: Culture cellulaire Techniques ELISA Antigènes p80 (NS2/3) ou gp44 (E0/Erns) En raison du masquage des antigènes par les anticorps colostraux

24 Les Veaux IPI , mal détectés par les techniques traditionnelles,
constituent le réservoir de virus dans les élevages Exemple: (Sandvik, VLA, UK, ESVV St-Malo, Aout 2003) 4 veaux IPI issus de mères infectés expérimentalement J0 (Avant buvée colostrale) J0 + 1 mois J0 + 2 mois J0 + 3 mois ELISA Serum E0 + +/- 1 Pos 3 Neg 3 Pos 1 Neg ELISA Leucocytes p80 - 2 Pos 2 Neg VI (Virus isol) PCR

25 Avec la PCR Temps Réel, les veaux de moins de 6 mois
IPI et VT (Tous?) sont détectables sur mélanges de 20 (Sang total sur EDTA) et différentiables sur prélèvements Individuels (Sang Total EDTA) Validations: LSI – France ( ) IVV – Suisse ( ) – Thèse de Kaiser, Berne (2001) Weinstock, USA (2002) - Malhum, USA (2002)

26 Utilisations du Test PCR BVD LSI sur sang EDTA
Veaux IPI et VT 2 Veaux IPI 2 Veaux VT Valeur seuil

27 Avec la PCR Temps Réel, les animaux de plus de 6 mois
IPI et VT (Tous?) sont détectables sur mélanges de 20 (Sang total sur EDTA ou Sérum – Tube Sec ) et différentiables sur Prélèvements Individuels (Sang Total EDTA ou Sérum – Tube Sec) Validations: LSI – France ( ) IVV – Suisse ( ) – Thèse de Kaiser, Berne (2001) Weinstock, USA (2002) - Malhum, USA (2002)

28 Utilisation du Test PCR BVD LSI – Mélanges
IPI Sang Total Individuel IPI Sang Total Mélange de 10 IPI Sang Total Mélange de 20

29 Les Kits TAQVET et T. Kits BVDV
Recherche du Virus BVDV SUR Lait (Individuel ou Tank) Sérum Individiduel et Mélange (20 Maximum) Sang EDTA Individuel et Mélange (20 Maximum) Organes, Peau Leucocytes, Cellules (Culture) Surnageant Culture Cellulaire, Serum Veau Foetal, Vaccin

30 Exemple de protocole d’utilisation des Kits PCR LSI Assainissement BVD après Validation de Facteurs de risque (Cliniques, Epidémiologiques, Statut du lait de Tank, Sérologie sur animaux sentinelles,…) Génisses, Taries, Hors-tank, Mâles (Plus de 6 mois) Veaux (moins de 6 mois) Vaches en lactation Lait de tank Tubes Secs ou EDTA Analyse sur mélanges de 10 à 20 sangs Tubes EDTA Analyses sur mélanges de 10 à 20 sangs Pos Analyses par pools de 5 puis individuelles Neg Absence d’IPI dans les VL Neg Absence d’IPI dans le lot testé

31 Kits LSI PCR BVDV Animal Type d’échantillon Prélèvement
Kit d’extraction Kit TAQVET LSI T . Kit LSI Bovins (+ de 6 mois) Sérum, Plasma, Sang total Tube sec, Tube EDTA Colonnes QIAamp Viral RNA Mini Kit® Plaques QIAamp® 96 Virus BiorobotTM Kit TAQVET BVDV Screening TAQVET BVDV Genotyping Serum T.Kit BVDV Serum Veaux (- de 6 mois) Sang total Vaches en lactation Lait individuel ou de mélange Lait frais avec conservateur (1 pastille de « broad Spectrum Microtabs® II ») QIAshredder® + RNeasy Mini Kit® RNeasy® 96 TAQVET BVDV Genotyping Cell T.Kit BVDV Cell Bovins (quelque soit l’age) Leucocytes du sang total Tube héparine Animal mort Organes Rate, ganglion mésentérique, poumon,…

32 Sérum, Plasma, Sang Total, Surnageant Culture Cellulaire
Echantillons Sérum, Plasma, Sang Total, Surnageant Culture Cellulaire Prélèvement : Sérum, Surnageant C C : Tube sec ou SST Plasma, Sang Total : Tube EDTA Transport : 48 Heures maximum / Réfrigérants Traitement à réception : Sérum, Plasma : Centrifugation rapide (48 h après prélèvement) Conservation des échantillons : +4°C / 8 jours maximum -20°C ou -70/80°C : 1 an au moins

33 Echantillons pour PCR Sérum, Plasma, Sang Total, Surnageant C C
Réaliser l’extraction le plus rapidement possible Extraction Colonne avec : QIAamp® Viral RNA Mini Kit : 28 µl de Sérum par échantillon Extraction Plaque avec : QIAamp® 96 Virus BiorobotTM : 40 µl de Sérum par échantillon Ajout de l’IPC exogène dans l’échantillon avant l’extraction

34 Echantillons Lait, Leucocytes, Organes Prélèvements : Transport :
Réaliser l’extraction le plus rapidement possible Prélèvements : Lait : Flacon de 40 ml + 1 cp de Bronopol Leucocytes, Cellules : Culot lavé à partir d’un tube avec anticoagulant Organes : Frais ou congelé Transport : 48 Heures maximum avec des réfrigérants Conservation des échantillons Lait : 8 jours à +4°C – Ne pas congeler Leucocytes, Cellules : Congélation immédiate Organes : Congélation immédiate

35 Lait, Leucocytes, Organes
Echantillons Lait, Leucocytes, Organes Extraction avec : RNeasy® Mini kit + QIAshredder® RNeasy® QIAshredder® 1 Culot leucocytaire ou cellulaire par extraction TAQVET Genotyping « Cell », T. Kit « Cell » : L’IPC Endogène (GAPDH) est directement contenu dans l’échantillon TAQVET Screening : L’IPC Exogène est ajouté à l’échantillon avant extraction.

36 2 T. Kits BVDV T. Kit « Serum » T. Kit « Cell »
Permettent la détection du virus BVDV avec un appareil de PCR Conventionnelle

37 Exemple de résultats T. Kits BVDV
Ce gel révèle une PCR avec : - le T.Kit BVDV « sérum » (échantillons 1 à 6). - le T.Kit BVDV « cellule » (échantillons 7 à 10). La bande IPC « cellule » est la plus haute des 3 bandes. La bande IPC « sérum » est la bande intermédiaire. La bande BVDV la bande la plus basse bande IPC cellule bande IPC Sérum bande BVDV

38 3 Kits TAQVET BVDV 2 Kits pour Génotypage 1 Kit Sans Génotypage
Kit TAQVET BVDV « Sérum » - Genotyping BVDV 1/2 Kit TAQVET BVDV « Cell » - Génotyping BVDV 1/2 1 Kit Sans Génotypage Kit TAQVET BVDV « Screening»

39 Sensibilité sur laits Dilutions d’un lait individuel positif en RNA BVDV1 en lait négatif en RNA BVDV1 et séropositif en Ac Anti BVDV (Lait homologue) Dilution T. Kit TAQVET Ct BVDV1 1/1 Pos 18,27 - Pos 1/10 22,21 - Pos 1/100 26,98 - Pos 1/500 30,78 - Pos 1/1000 Limite 32,09 - Pos 1/10 000 Neg 33,31 - Pos 1/ 35,52 - Pos 1/ 45 - Neg

40 Sensibilité sur mélanges de Sérums
Dilutions d’un sérum positif en RNA BVDV1 en Sérum négatif en RNA BVDV1 et séronégatif ou séropositif en Ac Anti BVDV Dilution Ct BVDV1 Sérum dilué en Sérum Ac Négatif Ct BVDV1 Sérum dilué en Sérum Ac Positif T. Kit 1/1 27,78 - Pos Pos 1/10 29,67 - Pos 31,22 - Pos 1/20 32,63 - Pos 32,78 - Pos 1/40 33,57 - Pos 34,58 - Pos 1/80 34,32 - Pos 35,76 - Pos Limite 1/100 36,85 - Pos 37,89 - Pos Neg 1/1 000 45 - Neg 1/10 000

41 Nouveau Kit TAQVET BVD Screening
Première Journée Lyonnaise de PCR Vétérinaire 26 Novembre 2003 Cécile Dives LSI Le Sémanet IV 1 bis allée de la Combe 69380 LISSIEU - FRANCE Tél:

42 Différences entre ancien et nouveau kit
Ancien kit BVD Screening Nouveau kit BVD Screening Sonde BVD1 FAM - TAMRA Sonde BVD FAM - MGB Sonde BVD2 FAM - TAMRA Sonde IPC VICTM - TAMRA Sonde IPC VICTM - TAMRA

43 Principe d’une sonde TaqMan® MGB
MGB = Minor Groove Binder Sonde libre dans le mix Q R AGGCCTTGAGAGATAT Sonde hybridée sur le brin d ’ADN R Q AGGCCTTGAGAGATAT TGGTCCAGTATCCGGAACTC T CT ATAGCATGTAG

44 Intérêt d’une sonde Taqman® MGB
Le complexe MGB augmente le Tm de la sonde et permet de travailler sur une zone très courte (13 à 20 mers). La sonde étant plus courte, elle est plus spécifique et permet de travailler plus facilement sur des zones variables.

45 Comparaison de résultats
Fluorescences brutes d’un faible positif Fluorescences brutes d’un fort positif Ancien Kit BVD Screening Ancien Kit BVD Screening Nouveau Kit BVD Screening Nouveau Kit BVD Screening

46 Détectabilité BVD sur la souche NADL
BVD Génotypage Résultas en Ct (Cycles Treshold) Echantillons BVD Génotypage BVD Screening NADL 10-2 28 26 NADL 10-3 32 30 NADL 10-4 37 34 NADL 10-5 38 39 Efficacité 94.7 % 99.7 % Nouveau kit BVD Screening

47 Détectabilité BVD sur la souche 890
BVD Génotypage Résultas en Ct (Cycles Treshold) Echantillons BVD Génotypage BVD Screening 28 30 32 34 37 39 Efficacité 99.0 % 99.9 % Nouveau kit BVD Screening

48 Détectabilité BVD sur d’une souche « intermédiaire » LSI
BVD Génotypage Résultas en Ct (Cycles Treshold) Echantillon BVD Génotypage BVD Screening Bs BVD1 = 35.77 BVD2 = 30.95 32.52 Nouveau kit BVD Screening

49 Avantages du nouveau Kit TAQVET BVD Screening
1/ Facilité d’interprétation des résultats. 2/ Garantie de la Sensibilité 3/ Spécificité optimisée par l’utilisation d’une sonde MGB

50 Ne pas utiliser les Tubes avec Héparine
Conclusions Les Limites de la PCR: 1/ Qualité des prélèvements: Tubes Secs, Tubes EDTA, Pots de lait avec conservateur Ne pas utiliser les Tubes avec Héparine 2/ Transport des prélèvements: Rapide (48 heures maximum) et sous couvert du froid (Packs réfrigérants 4°C) 3/ Coût de l’équipement 4/ Assurance qualité : Contrôles internes et externes pour la validation des analyses. Personnel qualifié et formé 5/ Droits de licence,…

51 Outil performant et économique pour optimiser le Contrôle de la BVD
Conclusions En association avec l’information des vétérinaires et des éleveurs, la méthode RT-PCR BVDV, permet: 1/ La détection des IPI et de la plupart des VT, sur tous les animaux y compris les veaux de moins de 6 mois 2/ L’utilisation des mélanges (Laits de Tank, Mélanges de prophylaxie, Achats, Assainissement,…) 3/ Le génotypage (à la demande) – LSI proposera le séquencage des virus BVD et SDRP au début 2004 Outil performant et économique pour optimiser le Contrôle de la BVD