XUGUANG LI, JOHNSON MAK, ERIC J. ARTS, ZHENGXIAN GU, LAWRENCE KLEIMAN, MARK A. WAINBERG,* AND MICHAEL A. PARNIAK *

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1 XUGUANG LI, JOHNSON MAK, ERIC J. ARTS, ZHENGXIAN GU, LAWRENCE KLEIMAN, MARK A. WAINBERG,* AND MICHAEL A. PARNIAK *

2  Le virus d’immunodéficience humaine :  Rétrovirus enveloppé de 90nm de Ø  Infecte en majorité les LT CD4+  Génome en ARN rétrotranscrit en ADN  Cycle viral contient une étape d’intégration du génome viral  Une étape critique au cycle viral est la rétrotranscription, réalisée par la Transcriptase Inverse.  Rétrotranscription possible grâce à la présence d’une séquence PBS (primer binding site) sur génome viral et grâce à une amorce cellulaire type ARNt Lys 3.

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4  Transfection de différentes lignées cellulaires à partir de constructions (ADN proviral) pPBSwt, pPBS(-), pPBS-Lys1,2 et pPBS-Phe.  Apparition des 3 transcrits majeurs du VIH  Pas d’effets du PBS sur l’expression du génome proviral.

5  Infection de lignée cellulaires MT4 à partir des virions obtenus de la lignée COS-7 et mesure de l’activité de la transcriptase inverse.  Chez les 2 mutants apparition du pic tardivement.  Pic d’activité RT en 1 semaine.  Incapacité d’infection par virus issus de pPBS(-) PBS(-) PBS-Lys1,2 PBS-Phe PBS wt inact PBS wt

6  2 ème infection à partir des virions obtenus aux pics d’activité RT.  Profil type WT pour l’ensemble des virions.  Emergence préférentielle d’un PBS wt ? PBS-Lys1,2 PBS-Phe PBS wt PBS wt inact

7  Control de spécificité de la PCR  Présence d’amplifiat correspondant au Wt. La baisse du signal est témoin de toxicité du virus  Amplifiats spécifique des formes mutées les 6 premiers jours et ensuite apparition de séquence PBS type wt. PBS-Wt PBS-Lys1,2 PBS-Phe

8  Présence de produit de retrotranscription dès 1 min avec le type sauvage.  Pour les PBS altérés le ssDNA n’est pas visible avant 15 min.  Aucun des tRNAs n’est capable d’amorcer la synthèse à partir du pPBS(-). pPBSwt pPBSLys1,2 pPBSPhe pPBS(-) tRNALys3tRNALys1,2 tRNAPhe Primers : Matrices RNA synthétiques :

9  Détection de l’ADN proviral complet dès 6 jours après infection pour les formes mutées de PBS.  Pour les mutants PBS, après 24 jours on ne retrouve au séquençage que du PBS wt.

10  L’altération de la séquence PBS n’a pas d’impact sur l’incorporation de tRNA spécifiques.  La séquence PBS n’est pas impliquée dans la sélection des tRNAs lors de l’assemblage du VIH-1 Control de spécificité Sondes complémentaires à : tRNA Phe tRNA Lys3 tRNA Lys1,2 pPBSwtpPBS(-)pPBSPhe pPBSLys1,2 RNA de particules virales issues de :

11  Les mutants PBS Lys1,2 et Phe sont infectieux malgré un délai dans la cinétique d’infection.  Néanmoins le taux de réplication de ces mutants atteint des niveaux de type sauvage.  Bonne efficacité des primers tRNA lys 1,2 et Phe lors de stades précoces d’infection, prise de relais par tRNA lys3.  Phénomène de réversion ?

12  Causes de la réversion ?  Implication d’interaction entre tRNA lys3 l’ARN viral et la RT  Implication de facteurs cellulaires?