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TECHNIQUES SPECIALES CULTURES CELLULAIRES CRYODECAPAGE CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE) TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES.

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1 TECHNIQUES SPECIALES CULTURES CELLULAIRES CRYODECAPAGE CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE) TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X

2 CULTURES CELLULAIRES Definition: La culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique ou de fécondation in vitrotechniquescroître cellulesexpérimentationscientifiquefécondation in vitro Les cellules mises en culture peuvent être: 1) des micro-organismes libres (bactéries ou levures)micro-organismesbactérieslevures 2) des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "cultureorganismebiopsieculture primaireprimaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions.divisions 3) des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). 4) des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie delignées cellulaires cancérisationcancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement. 5) des tranches d'organes (d'épaisseur optimisée selon le tissu)organesoptimisée

3 Conditions de travaille optimisation des conditions "atmosphériques" (ajout d'oxygène...)oxygène optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de certaines hormones,...)composition optimisation des supports (composition en biomolécules,...) culture sous agitationagitation co-culture avec des cellules "nourricières" culture sur des tissus préalablement "tués" par un procédé de congélation/décongélation congélation inclusion dans des gouttelettes d'alginateinclusionalginate Installation des instruments stériles Transfert dans un nouveau milieu pour fragmentation de l'embryon Introduction dans le flacon de culture d'une suspension de cellules d'embryons à l'aide d'une pipette stérile Mise à l'étuve des flacons pendant 24 heures à 37°C Aplication pratiques: 1.Letude des caracteres morphologiques et biologiques 2.Letude des biologie tissulaire 3.Letude in vivo des cellule: les effects des hormones ou des facteurs de croissance interaction entre different types des cellule

4 LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE Definition: La technique de cryodécapage consiste en cassant à part (fracturant) un échantillon biologique congelé; le détail structurel exposé par le plan de la fracture est alors envisagé par la déposition en vide de platine carbone pour faire un réplica (copie exacte) pour l'examen dans le microscope électronique de transmission. Étapes: 1.la congélation rapide 2.la fracture 3.produire le réplica 4.le nettoyage de la réplique

5 LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE Le protocole de travail: 1.La congélation rapide - dans les protocoles de routine, une étape de prétraitement est exécuté avant congeler, comprenant typiquement la fixation dans glutaraldehyde suivi par la cryoprotection avec glycérol. - pour congeler le tissu on doit plonger rapidement un échantillon convenablement monté dans un agent de refroidissement liquide (par ex., azote liquide). -pour éviter la formation des cristaux de glace, on appelle a létape de prétraitement; le cryoprotectant le plus utilisé est le glycérol; comme l'exposition au glycérol (ou d'autre cryoprotectants) peut causer des défets dans la structure de la membrane cellulaire, la pratique standard doit réaliser la fixation chimique avec glutaraldehyde d'abord. 2.La fracture - la fracture de l'exemplaire congelé est d'habitude réalisé sous le vide en utilisant une lame de microtome rafraîchie de d'azote liquide ou en cassant l'exemplaire congelé à part dans un dispositif articulé; la fracture se fait avec une lame de rasoir sous l'azote liquide à la pression atmosphérique; la fracture par la lame de microtome rafraîchie suppose le placement de léchantillon sur un support rafraichi. 3.Le nettoyage de la réplique - après réaliser la réplique, l'échantillon est apporté à la pression atmosphérique et à la température environnementale; la matière biologique est enlevée de la réplique en utilisant la solution du sodium hypochlorite, l'acide chromique ou d'autres agents de nettoyage; après le lavage dans l'eau distillé, les morceaux de réplique sont montés sur les grilles pour l'examen dans la microscopie électronique de transmission. 4.Résultats - un petit morceau du réplica est montait sur une grille, vue aux grossissements successifs; la première image dans la série montre le réplica comme vu sous le microscope binoculaire; les deux images suivantes sont de très bas grossissement en MET (microscopie électronique de transmission); pour refléter des détails, le grossissement dans le microscope électronique est augmenté davantage.

6 LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE Détails sur le protocole de travail Etapes de la technique de cryodécapage

7 LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE Aplication pratiques: le cryodécapage est unique parmi les techniques microscopiques car il fournit des vues planaires de l'organisation interne des membranes; la corrosion profonde des échantillons rapidement congelés permettent la visualisation de la structure de surface de cellules et leurs composants; les images fournies par le cryodécapage et les techniques collatérales ont changé profondément notre compréhension de la morphologie fonctionnelle de la cellule.

8 CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE) La centrifugation est une technique utilisant la force centrifuge pour séparer des fluides de densités différentes ou pour isoler des éléments solides en suspension dans un fluide.force centrifuge Permet de séparer les éléments d'un mélange en le faisant tourner à grande vitesse. Rotors a angle fixe pour les séparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protéines plus ou moins agrégées selon les cas) et le surnageant. Utilisé surtout pour des séparations séquentielles, ŕ des vitesses de rotation croissantes.

9 TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Chromatographie : est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. Phase de chromatographie: Phase stationnaire : phase fixe soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface plane. Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.analytes Chromatogramme : graphique dune fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) délution. La chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration. La chromatographie préparative est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions.

10 TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Classification: –classification selon la nature de la phase mobile : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ;chromatographie en phase gazeuse la chromatographie en phase liquide (CPL) ;chromatographie en phase liquide la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) ;chromatographie en phase liquide à haute performance la chromatographie en phase supercritique (CPS).chromatographie en phase supercritique –classification selon les interactions développées par la phase stationnaire : la chromatographie d'adsorption / d'affinité ;chromatographie d'adsorption la chromatographie de partage ;chromatographie de partage la chromatographie à échange d'ions ;chromatographie à échange d'ions

11 TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Chromatographie en phase liquide La chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et séparative principalement utilisée dans le domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines variés tels que la chimie organique et la biochimie. Elle recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase liquide en colonne ouverte ou à basse pression, et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés entraînés par un liquide (phase mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube (colonne chromatographique), soit fixé sur une surface inerte.chimie analytiquechimie organiquebiochimiechromatographie sur couche mincechromatographie sur papierchromatographie en phase liquide en colonne ouverte chromatographie en phase liquide à haute performance Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, une technique qui permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle est de plus en plus utilisée dans les principaux domaines de la chimie.moléculeschimie Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.

12 TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES (APLICATION PRATIQUES) La chromatographie sur papier –La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. chromatographie en phase liquideadsorbé chromatographie en phase liquideadsorbé –Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. éthanol –Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. –Le résultat est appelé chromatogramme. Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. –La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.

13 TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Application pratiques –La chromatographie est utilisée: dans les laboratoires d'analyses médicales par exemple pour évaluer la quantité de vitamines dans le sang dans le domaine sportif pour savoir si un athlète s'est dopé pour analyser les substances (poudres, liquides...) prélevées sur une scène de crime dans le cadre d'investigations en police scientifique.

14 TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES La technique de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d'ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.La technique de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d'ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.techniqueionsmoléculeschamp électriquetechniqueionsmoléculeschamp électrique Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode ().Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode ().anioniquesanode cationiquescathodeanioniquesanode cationiquescathode Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support :Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support : –électrophorèse sur papier ; papier –électrophorèse sur acétate de cellulose ; acétate de celluloseacétate de cellulose –électrophorèse sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide…). amidonagaragarosepolyacrylamideamidonagaragarosepolyacrylamide

15 TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES Gel d'électrophorèse –est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge électriquemacromolécules charge électrique –le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur.polymèretampon –deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le polyacrylamide. On peut faire varier la concentration de polymère par rapport à celle du tampon, ainsi que son taux de réticulation. Plus le polymère est concentré et réticulé, et plus la taille des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les propriétés du gel à la taille des molécules à analyser.agarosepolyacrylamide réticulation L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ;agaroseADNARN Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : protéines, peptides et des fragments d'acides nucléiques. On peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation.polyacrylamidepeptidespolymérisation

16 TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES Extraction de l'ADN et séparation par électrophorèse Matériel nécessaire Cuves à électrophorèse Micropipetage de l'ADN Le bleu de toluidine colore l'ADN Début de migration de l'ADN dans le champ électrique Résultat de l'électrophorèse

17 DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X La diffractométrie de rayons X (DRX) est une technique d'analyse basée sur la diffraction des rayons X sur la matière.diffractionrayons X La diffraction n'ayant lieu que sur la matière cristalline, on parle aussi de radiocristallographie. Pour les matériaux non-cristallins, on parle de diffusion.cristallinediffusion L'appareil de mesure s'appelle un diffractomètre. Les données collectées forment le diagramme de diffraction ou diffractogramme.diffractomètre Applications de la DRX - il est possible de la nature de chaque phase cristalline au sein d'un mélange (mélange de poudre ou échantillon massif polyphasique), à condition d'avoir auparavant déterminé la signature de chaque phase. - la méthode est qu'elle permet de distinguer les différentes formes de cristallisation d'un même composé. Cependant, elle ne peut généralement pas permettre d'identifier des composés amorphes. Cette technique est donc complémentaire de l'analyse élémentaire.analyse élémentaire - la méthode déterminer la identification de structures cristalline de lADN


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